PacBio相关知识
Pacific Bioscience公司简称PacBio
读长可达2-3万个碱基,平均长度8千个。
Pacbio测序也是边合成边测序。
DNA polymor固定在玻璃底板上:首先在聚合酶上标上生物素,在玻璃底板上标上链酶亲和素。利用生物素和链合亲霉素的亲和力结合在一起。
加入带四色荧光的dNTP引物,酶会长时间的抓住这个dNTP,激发光从底部照射进来,能在较长时间内发出荧光。一个循环完成后,焦磷酸基团掉落,进行第二轮,第三轮循环。
小孔设计:小孔直径70nm。
PacBio文库:DNA文库呈哑铃型。打开后即是一个圆形,可以周而复始的测序。
判读准确率:87.5%,(错误的原因可能是多读一个碱基,,错误是随机的,多读几遍之后,这些偶然误差是可以校正的。
PacBio读长的限制因素:
1,DNA链上出现缺口,激发光较强会导致DNA链出现缺口。
2,强光照射导致DNA酶变性,导致测序过程终止。
3,文库本身长度,要做20-30k的文库难度很大。
测序复合物:聚合酶,测序引物,测序模板。
一个板上有15万个小孔,由于测序复合物的随机不均匀分布,约有1/3的孔是空的,1/3的孔是一个复合物,1/3的孔有两个及以上的复合物。有效孔数约为5万个,产生的数据约为50000*8000=0.4G.
PacBio的优势:
1,PacBio可以直接测碱基被修饰的状态。如遇见甲基化的碱基,合成速度会放慢,光谱特征会改变。
2,建库过程无需PCR,由于PCR过程中AT碱基比GC碱基复制速度快,会导致最终AT的含量比较高,影响测序质量。GC bias少。
3,测序速度快:测序速度取决于酶反应速度,一秒3个碱基。
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