生物信息学习的正确姿势

NGS系列文章包括NGS基础、在线绘图、转录组分析 （Nature重磅综述|关于RNA-seq你想知道的全在这）、ChIP-seq分析 （ChIP-seq基本分析流程）、单细胞测序分析 (重磅综述：三万字长文读懂单细胞RNA测序分析的最佳实践教程)、DNA甲基化分析、重测序分析、GEO数据挖掘（典型医学设计实验GEO数据分析 (step-by-step)）、批次效应处理等内容。

之前整理的一篇大综述 — Nature重磅综述 |关于RNA-seq，你想知道的都在这收到了热烈反响，阅读人数过万。

行文很长，最后精炼下来的文字近三万，适合深度阅读思考。

上次发出时，有读者留言说部分专业名词不理解。为了方便理解和对综述有个概览，特整理了下面的思维导图，对应原文，共计8个大标题，大标题下又分有小主题，各个分支介绍有每个主题的主要内容及采用方法。

内容已发布在石墨文档，链接如下：

https://shimo.im/mindmaps/qQVV3r3Pqx8DVGjC/ 《RNA-seq思路图（欢迎大家备注、修改，可先创建副本，在副本文件修改）》，可复制链接后用石墨文档 App 或小程序打开

Note：想要打开全部分支、添加备注或修改信息，请先创建副本，在备份文件打开修改，原文件不支持修改

原文在深度总结了RNA-seq这些年的同时，还分享了文中一些名词的解释，编译分享如下，希望有助于进一步理解学习。

• NGS基础 - FASTQ格式解释和质量评估

• NGS基础 - 高通量测序原理

• NGS基础 - 参考基因组和基因注释文件

• NGS基础 - GTF/GFF文件格式解读和转换

• NGS基础 - 测序原始数据下载

• 如果不是没有钱，谁想测3个重复？

1. Read depth Read深度：一个样本测序得到的reads数；容易和基因组测序的覆盖度 (多少基因组区域被测到了)和测序深度混淆 (单个核苷酸被测到的次数或所有核苷酸被测到的平均深度)。

2. Short-read 短读长：测序得到的长度最大是500 bp的reads，常见的测序片段长度为100-300 bp；本文中的短读长测序片段代表测到的mRNA片段和降解了的mRNA。

3. Long-read 长读长：测序得到的超过1000 bp的reads，本文中代表全长或近乎全长的mRNA。

4. Direct RNA sequencing (dRNA-seq): 直接测序RNA而非cDNA的测序技术，通常用于测序全长或近全长的mRNA 。

5. Multi-mapped reads 多重比对的reads：从转录组同源区域测序得到的reads，不能精确确认其转录本或基因组的来源。

6. Synthetic long reads 合成long reads：通过组装多个短读长得到长读长的方法。

7. 唯一分子标识符（UMIs）：在扩增前，构建RNA-seq文库的时候加入的短序列或barcodes，理想情况下每条转录本结合一个唯一的标识符，含有此标识符的reads都来源于此转录本，定量时只计算一次。可以用来降低RNA-seq的定量偏好性，在RNA起始量低的单细胞实验中尤为适用。

8. Read length 读长：单个测序reads的长度，short-read RNA测序得到的长度通常是50-150 bp。

9. Sensitivity 敏感性：样本中多大比例的转录本会被测到，敏感性越高，这一比例越高。它受样本处理、文库制备、测序和计算偏好性的影响。

10. Specificity 特异性：度量差异表达转录本被正确鉴定出的比例的方法，它受样本处理，文库制备，测序和计算偏好性的影响。

11. Duplication rates 重复Reads比率：比对到转录组相同位置的的测序reads的比例。在RNA-seq文库中，一些转录本可能有高的重复率，因为它们在样本中表达水平高。高表达的基因的重复率很高，而低表达基因的或许有着最小的重复率。由此RNA-seq面临着一个挑战，该技术中大部分重复可能是高表达转录本带来的真实信号，而另一些则是由于扩增和测序偏好性造成的。

12. Single-end sequencing 单端测序 (SE)：只测序cDNA片段的一端，因其费用低，常用于只关注差异基因表达的项目中。（NGS基础 - 高通量测序原理）

13. Paired-end sequencing 双端测序 (PE)：cDNA片段两端分别测序，可以测序到cDNA的更多碱基，更好的识别剪接位点，常于差异基因表达分析项目。

14. 生物学重复：对生物来源不同的样本的多次检测，比如来自三个个体的组织，用于捕获生物个体自身的变化；这个变化要么是待研究的对象，要么是噪音。相较之下，技术重复是对同样的样本做重复的操作—比如，对一个组织做三次处理。

15. Expression matrix 表达矩阵：差异表达RNA-seq项目的核心数据文件。每一行代表一个RNA，比如基因或者转录本。每一列是一个测序的样本。矩阵中的数值是每个RNA的reads数。这些可能是对转录异构体的计数估计，并通常在后续的分析前先进行标准化转化。

16. Spike-in control 内参：按特定浓度添加到样品中的外源核酸库。它们通常是预先合成的不同浓度的RNA，用于监测反应效率和技术方法的偏差和假阴性结果。

17. Spatialomics 空间转录组学：能保留给定样本（通常是组织切片）中每个转录本的空间信息的转录组分析方法。

18. Nascent RNA 新生RNA：刚刚转录出来的RNA，与已经加工并运输到细胞质的RNA相对应。

19. Translatome 翻译组：细胞、组织或生物体中正在翻译成蛋白质的mRNA集合。

20. Structurome 结构组：细胞、组织或生物体中RNA的二级和三级结构集合。

21. Interactome 互作组：细胞、组织和生物体中分子相互作用的集合，包括有RNA-RNA或者RNA-蛋白质的相互作用。

22. Differential gene expression (DGE) 差异基因：两个实验组中表达显著变化的基因。

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