综述：微生物群落的生物技术潜力及应用

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编译：赵博

英文标题：

Biotechnological potential and applications of microbial consortia

中文标题：

微生物群落的生物技术潜力及应用

第一作者：

Xiujuan Qian¹

通讯作者：

Min Jiang^1,2，Fengxue Xin^1,2

期刊：

Biotechnology Advances

作者单位：

1 State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing, China

2 Jiangsu National Synergetic Innovation Center for Advanced Materials (SICAM), Nanjing Tech University, Nanjing, ChinaAHLs

摘要

微生物群落的最新研究进展为扩大代谢工程的范围提供了一种有效的方法。系统生物学使我们能够全面的了解细胞的各种生理过程及其相互作用，从而为合成微生物群落的优化设计提供了见解。然而，合成微生物群落的研究仍处于起步阶段，在细胞间通讯和稳定可控的微生物群落系统的构建上面临着许多未知和挑战。本文全面综述了已定义的微生物群落在人类健康管理和药物开发、有价值化合物合成、木质纤维素材料的联合生物加工和环境生物修复等领域的最新应用。同时，重点介绍了高效、稳定、可控的合成微生物群落进一步发展所面临的突出挑战和未来发展方向。

引言

采用无氧培养的传统代谢工程为生产大宗化学品和有价值的产品提供了很好的机会。然而，外源基因固有的排他性、新酶的缺乏、沉默途径的存在以及对严格培养条件的要求总是影响生物产品的效价和生产力。因此，商业化微生物过程生产化学品和燃料的成功案例数量无法满足预期，这就留下了一个问题：传统的代谢策略，即“超级细胞工厂”的建设，是否足以支持可持续的生物炼制。

然而，传统的食品发酵工艺，如奶酪和酱油的生产通常是使用由多个菌株或物种组成的混合培养物。此外，环境中99%以上的微生物无法通过传统的培养技术得到成功的培养。天然微生物菌群强大的特性启发研究人员将合成生物学从传统的单细胞设计扩展到混合培养系统的构建。正如预期的那样，近年来，越来越多涉及探索微生物群落潜力、群落内不同微生物合成途径分布、细胞间通讯机制以及微生物群落系统统计模型建立的研究被广泛报道（图.1）。

图.1 微生物群落发展中一些关键里程碑的时间简表

人工微生物群落的构建在系统复杂性和功能性方面开辟了合成生物学的新视野。首先，这些复杂的菌群为菌株创造了一个新的微环境，可能导致“正常”培养条件下不表达的沉默代谢途径的激活，从而导致新的化学物质被发现，这赋予了微生物菌群广阔的应用前景，特别是在新药物开发中。此外，人体内微生物菌群的行为是影响人类健康的一个重要因素，因为人类正在与寄生在我们体内的数万亿微生物共同进化，这些微生物创造了具有复杂性、人体栖息地特异性和适应性的生态系统，以适应不断变化的宿主生理状态。其次，微生物群落采用“分工”的方法，种群间相互分担负荷，从而与单一菌株相比提高了效率且能够完成更加复杂的行为。在菌群中，通过改变组成菌株的比例可能更容易优化模块化的通路，而使用单一菌株培养时，需要对启动子、核糖体结合位点、终止子和载体等进行一系列的分子工程操作。再次，这些人工微生物群落由多种功能微生物组成，相对于单一菌株，它们对于环境条件的挑战更有活力，具有更大的代谢能力。

在本篇综述中，全面的总结和讨论了人工微生物群落近期在人类健康管理、有价值化合物合成、木质纤维素生物炼制的联合生物加工和环境生物修复等领域的应用，强调了合成微生物群落的构建策略，旨在开发出微生物群落在更多领域的应用潜力。同时，本文进一步指出了人工微生物群落发展所面临的重大挑战和未来发展方向。

微生物群落在人体健康管理中的应用趋势与潜能

1929年，亚历山大·弗莱明利用青霉菌和葡萄球菌组成的微生物群落意外发现了青霉素，这被认为是上世纪最具影响力的科学突破之一。此后，随着生物技术的发展，越来越多的新型化学物质被发现。表1总结了过去10年报道的利用微生物群落合成的新化学物质，可以看到，他们中的大多数表现出抗菌特性，只能在微生物群落系统中被发现。由于致病性抗生素耐药菌株数量的增加，新的抗生素的研究和开发的需求比以往任何时候都更加迫切。微生物群落的独特特性明显地突出了其在抗生素化学合成中的潜力。

表1 混合培养发现的新次级代谢物的最新研究

越来越多可获得的微生物基因组序列表明，在标准的实验室条件下，许多负责合成次级代谢产物（SMs）的生物合成基因簇可能是沉默的，例如，支霉菌中沉默的糖肽基因簇。有证据表明，一些沉默基因簇的激活需要其他微生物的实体存在。为了发现微生物群落背后未被揭示的相互作用机制，从物理接触、化学通讯和基因突变的角度开展了一系列的研究（图.2）。

在化学通讯方面，微生物可以产生一些信号化合物，如N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）和小肽，在“群体感应”（QS）过程中充当转录调节因子和表观遗传修饰因子。AHLs是革兰氏阴性菌用于种内QS的一类主要自诱导信号分子，一旦环境中的AHL浓度达到阈值水平，就会激活LuxR家族的转录调节蛋白。LuxR/AHLs复合物可以激活多个靶基因的表达，包括AHLs合成所需的基因（图.2a）。这种QS机制已经成功地在大肠杆菌中应用，构建出了细胞间通讯的时空调节，通过调节细胞生长和死亡来控制微生物群落中的种群数量，以减少不同物种之间的基质竞争。在革兰氏阳性菌群中，被称为自诱导肽(AIPs)的小肽主要用作QS分子。与AHLs不同的是，这些多肽在序列和结构上各不相同，它们通过专用的转运蛋白从细胞主动运输至胞外。AIPs调控的QS系统通常采用一种双组分遗传调节机制——膜结合的AIP受体-组氨酸激酶（HK）和DNA结合反应调节因子（图.2b）。一旦细胞外环境中的AIP达到临界浓度，它将被受体HK磷酸化并导入细胞。磷酸化的AIP将与目标DNA结合，调节其转录。化学通讯除了存在于同一属中之外，QS分子似乎也影响原核生物-真核生物的相互作用。例如，苷色酸衍生物通常在真菌/细菌的互利共生中被发现，这意味着苷色酸在微生物通讯中的功能作用。基于以上发现，通过将QS分子的产生与相应的受体和启动子关联起来，更容易构建一个通信系统，从而可以设计出一个可控的微生物群落。

除了图.2a和b中所示的自由扩散的QS分子外，一些信号分子的输送也需要特殊的结构辅助。例如，长链AHLs等疏水信号分子通过膜囊泡(MVs)在细胞间运输（图.2c）。在某些情况下，微生物群落中的细胞间需要亲密物的理接触，以引出特定的交流。典型的例子是构巢曲霉与放线菌的相互作用，在这种情况下，典型的多酮类化合物只有在群落中的两个细胞进行物理接触后才能被生物合成（图.2d）。

进一步的基因水平分析表明，微生物群落通过基因丢失、组蛋白修饰和水平基因转移等方式引起了一系列基因表达的改变（图.2e）。例如，棒状链霉菌与金黄色葡萄球菌N315共培养，导致棒状链霉菌中一个1.8Mbp的大型质粒丢失，该质粒占其基因组含量的21%。结果是棒状链霉菌获得了在这个微生物群落系统中结构性地产生全霉素的能力。推测这是因为棒状链霉菌基因片段的丢失可能会减轻复制和基因表达过程中的代谢负担，于是沉默的全霉素合成途径被特异性激活，它是抗生素吡咯啉类的成员，对金黄色葡萄球菌表现出很大的细胞毒性水平。细菌也可以通过主要组蛋白乙酰转移酶复合物Saga/Ada诱导组蛋白修饰来改变真菌基因表达。通常，组蛋白乙酰化与转录激活有关，从而起到调控基因表达的作用。此外，基因组分析显示，红球菌307CO在微生物群落系统中含有一个来自链霉菌的大DNA片段，导致红链霉素A和B的新同分异构体抗生素的产生。事实上，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌之间的水平基因转移是常见的，这可以被定义为捕食，会导致捕食者将猎物DNA并入其中。

微生物群落内部的相互交流是一个非常复杂的过程。目前，探索这种相互作用机制的最有效途径是通过表征小样本以降低复杂性，检测特定的代谢相互作用或引入报道菌株，然后构建具有代表性的微生物群落模型库。相应地，应发展更先进的感知和分析技术，如宏基因组学、系统生物成像质谱仪、微流控技术和流式细胞仪、细胞分离和打印、高通量培养等。

除了抗生素化学物质的发现，微生物群落在临床研究中也有着光明的应用前景。定居在人体内的微生物，包括粘膜和皮肤环境中的，至少与我们的体细胞一样丰富，而且含有的基因肯定比人类基因组多得多。除了遗传和环境因素外，人体内微生物菌群的行为也是影响人类健康的重要因素。例如，肠道微生物菌群现在正成为个性化医疗中的重要参与者，因为它能够分解人体原本无法消化的多糖，并且对于肠道免疫系统的发育和动态平衡至关重要，能够抵抗病原体。加强对微生物群落影响的理解和更好地阐述这类群落内确切的运行机制也已成为人类微生物组的优先研究内容。

图.2.微生物群落的相互作用机制模型。（a）革兰氏阴性菌群的群体感应。在典型的革兰氏阴性LuxIR环路中，LuxI型蛋白催化合成N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）自诱导物（五边形）。一旦AHLs在环境中浓度达到阈值水平，就会激活LuxR家族的转录调节蛋白。LuxR/AHL复合物可以激活多个靶基因的表达，包括AHLs合成所需的基因。（b）革兰氏阳性菌群的群体感应。自诱导肽（AIPs）从细胞主动输出并结合到细胞外受体-HK的传感器区域。当AIP在环境中达到临界浓度时，受体HK将其磷酸化并导入细胞，磷酸化的AIP将与目标DNA结合，调控其转录。（c）使用膜囊泡(MVs)的信号分子传输模型。革兰氏阴性菌从细胞表面将产生的细胞掐掉，形成一个球形容器。MVs与受体细胞融合，传递疏水信号分子，随后激活靶基因的转录。（d）物理接触模式。典型的例子是构巢曲霉与放线菌密切接触，导致Saga/Ada复合物催化组蛋白H3乙酰化的增加。（e）微生物群落的基因水平变化。混合培养可引起基因表达的一系列变化，表现为基因丢失、组蛋白修饰和水平基因转移。

利用菌落中不同菌种间代谢途径的分布合成有价值的化合物

合成生物学和代谢工程在合成高价值产品的模型微生物（如大肠杆菌和酿酒酵母）的构建和代谢途径优化方面取得了很大的进展。通常，这些产物只能通过较长或复杂的代谢途径合成。例如，由葡萄糖合成紫杉醇需要35~51个步骤。通过对大肠杆菌的代谢途径进行修饰，得到了最高的紫杉醇前体物——紫衫烯滴度，为1.02g/L。然而，这一过程与工业生产仍有很大的差距。在另一项研究中，在酿酒酵母中构建了一条包含10个基因的生物合成途径，用于从(R,S)-全去甲劳丹碱合成二水血根碱和血根碱。这种复杂的生物合成途径只能使1.5%的反应物转化为二水血根碱。通常，当多个基因同时引入到单一微生物中时，生物合成效率会显著降低，因为这会给底盘细胞带来巨大的代谢压力。这一普遍存在的问题可以通过使用合理设计的微生物群落来克服，微生物群落可以将一条生物合成途径模块化并分离在多个独立的细胞中。因此，每个底盘细胞都可以独立设计，以实现联合通路的最佳功能。

表2总结了有用化合物生产的最新进展。根据微生物群落中微生物种类的不同，对这些成功的尝试进行分析，分为细菌-细菌、真核生物-真核生物和细菌-真核生物三大类，为更多人工微生物群落的构建提供了具体的经验。在细菌-细菌体系中，大肠杆菌是最常用的底盘菌株。Zhang等设计了一种新型大肠杆菌-大肠杆菌共培养体系，用来生产顺，顺-己二烯二酸（MA）和4-羟基苯甲酸（4HB），这两者都是制造增值化合物如己二酸、对苯二甲酸、穆康酸和香草醇的重要中间体。在该研究中，利用第一株大肠杆菌转化葡萄糖为中间体3-脱氢莽草酸（DHS），再由第二株大肠杆菌同化转化为MA或4HB。为了消除这两个菌株之间的碳源竞争，在第一个菌株中去除了磷酸转移酶系统，在第二个菌株中删除了催化D-木糖和D-木酮糖相互转化的木糖异构酶基因xylA。由此产生的微生物群落可以同时消耗木糖和葡萄糖。这一策略成功地克服了中间体分泌水平高、糖液利用效率低的局限性。这一原理还被用于从葡萄糖和甘油混合物中生产生物聚酰胺合成所需原料——尸胺，以及从葡萄糖和木糖混合物中生产糖苷。此外，通过将上游和下游通路调节到两个独立的大肠杆菌菌株中，Zhang等人构建了以甘油为唯一碳源来支持两株菌生长和MA生产的微生物群落系统。大肠杆菌-大肠杆菌共培养可用于单一碳源环境下的复杂生物合成工程，而不考虑这两个菌株之间的生长竞争。通过将设计好的4-乙烯基酚或4-乙烯基儿茶酚生产模块与氰基-3-O-葡萄糖苷生产重组细胞组装在一起，首次报道了利用大肠杆菌共培养合成重要的红酒色素——吡喃花青素。采用该方法提取吡喃花青素比传统的植物提取方法更稳定。此外，合成大肠杆菌群落系统已经被设计用于越来越多有价值化合物的生产，包括像咖啡酰苹果酸这样的酯类化合物，像α-蒎烯这样的萜类化合物，像白藜芦醇这样的多酚化合物，白藜芦醇葡萄糖苷，像3-氨基苯甲酸（3AB）这样的氨基酸衍生物，尸胺，像芹黄素葡萄糖苷这样的黄酮类化合物，像水杨酸2-O-b-D葡萄糖苷这样的糖苷化合物和单醇等。除了大肠杆菌外，还设计开发了氧化葡萄糖杆菌和古龙酸菌的共培养技术，用于一步生产维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸（2-KGA）。

表2 模块化共培养工程在有复合生产中的应用

与细菌-细菌群落系统相比，真核-真核生物的尝试报道较少。一个典型的例子是莫纳可林J及其衍生物洛伐他汀（一种非常重要的用作抗高胆固醇血症药物的天然产品）的生物合成模块，可以组装到两株巴斯德毕赤酵母菌株中。微生物群落可从甲醇中产生250.8mg/L的洛伐他汀和593.9 mg/L的莫纳可林J。与单培养相比，洛伐他汀的生物合成能力提高了2.2倍，莫纳可林提高了13.4%。

不仅限于原核生物之间的合作，细菌和真核生物之间的跨物种群落也已经发展起来，用于生物合成复杂的有价值产品。例如，Rodríguez-Bustaante等人分离到一个由酵母菌Trichosporon asahii（阿萨希丝孢酵母）和细菌Paenibacillus amyllyticus（解淀粉类芽孢杆菌）组成的微生物群落，其中T.asahii负责将叶黄素分解成β-紫罗兰酮，而P.amylolyticus 将β-紫罗兰酮还原为7,8-二氢-β-紫罗兰酮和7,8-二氢-β-紫罗兰醇衍生物，它们是烟草香气中存在的化合物。在另一种工程肠杆菌和酿酒酵母的跨物种共培养中，以葡萄糖为唯一碳源的条件下产生了2mg/L的含氧紫杉烷（有效的化疗药物），尽管它们都不能产生紫杉醇前体。在此过程中，工程大肠杆菌负责上游紫杉烯的从头合成，然后通过酿酒酵母将其转化为氧化紫杉烷，其中细胞色素P450模块被有效表达。然而，酿酒酵母产生的乙醇显著抑制了大肠杆菌的生长和紫杉烷的产生。因此，为了更好地控制这两个菌株的种群分配，采用了共生碳源方法，其中木糖被大肠杆菌消耗并转化为乙酸，然后乙酸被酿酒酵母进一步代谢为氧化紫杉烷。经过基因改造后，最终获得了33毫克/升的高水平氧化紫杉烷产量。最近，Zhang等人构建了大肠杆菌和酿酒酵母的交叉培养物以提高柚皮素的生产效率，柚皮素是一种有价值的天然产物，广泛分布于芸香科柑桔属植物中。具体而言，内源酪氨酸途径被引入大肠杆菌中用以高水平的产生酪氨酸，随后被下游工程酿酒酵母转化为柚皮素。结果，从木糖中最终产生21.16mg/L的柚皮素，与酵母菌单一培养相比，滴度增加了8倍。这种系统也被设计用来在工程酵母之间交换酪氨酸和精氨酸。

除了两种微生物的相互作用之外，含有三种或三种以上菌株的多物种培养联合体也被成功地用于构建较长的串联或平行合成途径。例如，已经设计了包含大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和希瓦氏菌的工程混养物用于微生物发电。在此过程中，大肠杆菌首先消化葡萄糖产生乳酸，乳酸被用作碳源和电子供体。随后，乳酸盐被枯草芽孢杆菌转化为核黄素用于电子穿梭。最后，希瓦氏菌作为外生电因子来发电。反过来，希瓦氏菌氧化乳酸盐产生乙酸盐，乙酸盐作为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的碳源。因此，这三个物种形成了一个互养的微生物群落，它们在一起能够更好地产生能量。在优化的条件下，11mM的葡萄糖可以转化为稳定的约550 mV的电力输出超过15天。模块化的共培养工程的潜能可以解决与复杂和非线性生物合成途径相关的挑战。通过使用混合碳底物来最小化上游碳通量的竞争，构建了由三个大肠杆菌菌株组成的高效微生物群落系统，用于非线性迷迭香酸合成。与单一培养相比，迷迭香酸产量提高了38倍。另一个混合培养的例子是花青素的合成，花青素是一种重要的保健色素。在该研究中，将生产苯丙酸、黄烷酮、黄烷-3-醇和花色苷的15个酶促反应分置于4个独立的大肠杆菌菌株中，首次实现了异源生产黄烷-3-醇。这项研究代表了迄今为止最复杂的合成联合体，为代谢工程在外源宿主中重建广泛的代谢途径提供了新范例。

尽管在利用微生物群落合成有价值化合物方面已经取得了显著的进展，但利用这种多物种培养实现工业化应用仍然是一个巨大的挑战。在未来，除了需要讨论模块化菌种选择和折衷培养条件的优化外，还应考虑更多的实际问题：①如第一部分所讨论的，不同微生物之间的物理接触会导致一些次级化学物质的产生，这给控制微生物种群结构带来了更大的困难，并且应考虑这些诱导产生的次生化学物质是否会影响合成的天然化学物质的质量；②与单细胞工厂相比，微生物群落内的各个物种将通过底物或中间体的交换而相互作用，如何提高细胞间底物或中间体转移的效率是构建高效微生物群落的关键。此外，一些中间代谢物的浓度较低，这会给配对微生物有效地感知和捕获它们带来困难。因此，应该设计一些通用的发酵设备来加强微生物群落系统内的底物或中间体的转移；③微生物群落系统是动态的，很难实现长期的生产稳定性。因此，现在从实验的角度来判断微生物群落的潜力还为时过早。所以应该进行更多的大规模试验，特别是长期的培养过程。由于稳定性、可控性、安全性和成本是评价工业生产过程的关键因素，因此在以后的实验设计中应更多地关注这些方面。

1. Qian, X.J., Chen, L., Sui, Y., Chen,C., Zhang, W.M., Zhou, J., Dong, W.L., Jiang, M., Xin, F.X., Ochsenreither, K.,2020. Biotechnological potential and applications of microbial consortia.Biotechnology Advances 40.

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0734975019302009#t0005

中国科学院生态环境研究中心

环境生物技术重点实验室

邓晔研究员课题组发布

编译：赵博

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