1.2022复习重点及参考题

2022年考试复习题：

1.2021-2022 学年第 2 学期考试复习题
一、名词解释（8×2 分）

PCR
转化转染转导
结构域
保留时间
反向键合相色谱法
分辨率
液相色谱质谱联用
核磁共振

二、选择题（1×10 分）
1.在使用荧光定量 PCR 小时，结果显示 Cq 值越大，说明模板初始量____？
A.多 B.少
2.使用荧光定量 PCR 的目的是________？
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A 扩张大量的模板
B 得到大量的产物
C 测量其初始模板的量
3.荧光定量 PCR 中，可以进行多重反应？
A Taq man 探针和 SYBR Green1
B Taq Man 探针和 Beacon 探针
C Taq man 和 LUX Primer
D SYBR Green 和 ROX
4.气相色谱质谱适用的物质是？
A 易挥发和热稳定
B 不易挥发和热稳定
C 易挥发和热不稳定
D. 不易挥发和热不稳定
5.下列哪个离子源可以产生有特征性的谱峰
A EI B CI C ESI D IDEAL
6.液相色谱质谱定性定量的依据是____?
A 保留时间和峰高
B 保留时间和峰面积
C 保留时间和质谱图
7.胰蛋白酶对蛋白质中哪些氨基酸进行切割____?（多选）
A 脯氨酸 B 精氨酸 C 赖氨酸 D 苯丙氨酸 E 亮氨酸
解析：胰蛋白酶是一种选择性水解精氨酸和赖氨酸肽链的内肽酶，可以将天然蛋白质、
变性蛋白质、纤维蛋白和粘蛋白水解成多肽或氨基酸。
8.下列哪个因素不会影响电渗率
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A pH B 离子强度 C 温度 D 浓度
9.电渗推动液流的前端的形状是____？
A 双抛物线 B 抛物线 C 塞形 D 直线. 10.等速电泳的定性定量依据是____？
A 保留时间，峰高 B 保留时间，峰面积
C 电导，区带宽度 D 电阻，保留时间
解析：等速电泳是一种不连续介质电泳技术,早期它被称为置换电泳、离子移动法或恒
电泳等，亦称等速电泳

三、简答题（8×4 分）
1.简述 4 点气相质谱和液相质谱的异同点
2.简述反向键合相色谱法的原理
3.简述蓝白斑实验的原理
4.简述蛋白纯化的策略和基本方法
5.质谱环境真空的原因
6.原子有哪些能级，哪个能级的跃迁的能量是在 1~20 电子伏特之间
7.简述需要进行 CTF 矫正的原因
8 简述 GFP 蛋白发射荧光的原因

四、问答题（2×5 分）
1.写出 4 种可以提高 CRISPR 技术特异性的改进方法

附录：参考答案及复习重点

一、名词解释（8×2 分）
1.PCR
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术
2.转化转染转导
转染通常是指将核酸输送到真核细胞（动物细胞）。
转化通常用来描述细菌、非动物真核细胞和植物细胞中非病毒 DNA 的转移
转导用于描述病毒介导的 DNA 转移。
3.结构域
结构域 domain 是在较大的蛋白质分子中，由多肽链相邻的超二级结构紧密联系，进一
步折叠形成一个或多个相互独立的致密三维实体，称为结构域
4.保留时间
气相色谱中从进样开始到某个组分的色谱顶点的时间间隔称为该组分的保留时间。即
从进样到柱后某组分出现浓度极大时的时间间隔。
5.反向键合相色谱法
反相高效液相色谱是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。以被测的
高分子为固定相、以惰性气体为流动相，为了测定需要，在流动相中加入一些探针分
子，它们是挥发性的低分子。将探针分子注入气化室气化后，由载气带入色谱柱，测
定它们在两相中的分配，从而研究高分产的各种性质，高分子与探针分子的相互作用
以及高分子与高分子间的相互作用。
6.分辨率
分辨率：分辨能力是电子显微镜的重要指标，电子显微镜的分辨能力以它所能分
辨的相邻两点的最小间距来表示，即称为该仪器的最高点分辨率. 7.液相色谱质谱联用
液相色谱-质谱联用仪（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer），简称 LC-MS，
是液相色谱与质谱联用的仪器。它结合了液相色谱仪有效分离热不稳性及高沸点化合
物的分离能力与质谱仪很强的组分鉴定能力。是一种分离分析复杂有机混合物的有效
手段。
8.核磁共振
核磁共振是磁矩不为零的原子核，在外磁场作用下自旋能级发生塞曼分裂，共振吸
收某一定频率的射频辐射的物理过程。主要用于测定物质的化学成分和分子结构

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1.简述 4 点气相质谱和液相质谱的异同点

1.气相：气相色谱是一种物理的分离方法.利用被测物质各组分在不同两相间
分配系数（溶解度）的微小差异,当两相作相对运动时,这些物质在两相间进
行反复多次的分配,使原来只有微小的性质差异产生很大的效果,而使不同组
分得到分离. 2.液相：高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论, 在技术上,流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9′107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测.

2.简述反向键合相色谱法的原理
反相高效液相色谱是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，
典型的固定相是十八烷基键合硅胶，典型的流动相是甲醇和乙腈。在反相键
合相色谱中，极性大的组分先流出、极性小的组分后流出。

3.简述蓝白斑实验的原理
蓝白斑筛选：外源 DNA 片段插入后会破坏 MCS 与菌株编码的 lacZ 的 C 端
部分序列形成的α互补，因此如果外源 DNA 片段没有插入质粒，在 IPTG 诱
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导下，互补的β-半乳糖苷酶可以分解无色底物 X-gal，形成蓝色菌落；如果
外源基因片段插入，阅读框被破坏，不能分解培养基中的 X-gal，因此重组
质粒在培养基表现为白色菌落。

4.简述蛋白纯化的策略和基本方法
蛋白质分离纯化纯化策略 ①样品捕获； ②中度纯化； ③精细纯化

5.质谱环境真空的原因
减少离子与背景气体的碰撞淬灭，真空使背景气体分子数量大大减少，
以维持足够的离子平均自由程

参考答案：

2.2021复习重点及参考题

3.往年复习重点及参考题汇总

4.复习重点整理及考试题型

1、目的基因的获取
（1）天然来源获取目的基因：限制性核酸内切酶
（2）人工合成目的基因
2、构建基因表达载体
（1）克隆载体：
（2）表达载体：
3、将目的基因导入受体细胞
（1）DNA 测序技术：确定重组载体 DNA 序列的正确性
（2）转染、转化、转导：外源基因导入宿主细胞的方法
4、目的基因的检测与鉴定
（1）目的基因是否转入宿主细胞：①蓝白斑筛选 ②Southern 印记法
（2）目的基因是否转录出了 mRNA：①Northern 印记法
（3）目的蛋白质是否表达：①SDS-PAGE 电泳结合肽指纹谱测序
基因工程实验技术-1
1.基因工程（Genetic engineering）
2.基因工程技术的目的：（1）改变物种原有的遗传特性；（2）获得新品种；（3）产生新产品
3.基因工程的基本步骤：（4 步）
4.限制性核酸内切酶
5.限制性核酸内切酶分为 3 种，其中（）是最常用的一种，它有特定的识别序列，长度一般为 4-6 nt，
且呈二重对称，有特定的酶切位点，能在识别序列的特点位点处对双链 DNA 进行切割，产生特定的酶切末端。
6.（）兼具限制、修饰 2 种功能，有特点的识别位点和切割位点，切割位点一般距离识别位点 3’
端（）bp，因为已发现的种类太少，基因工程中不常用。
7. 星活性（Star activity）：
8.保护碱基：
9.（）是寡聚核苷酸化学合成的首选，它的合成方向是（），与常规的酶促反应相
反，通过受保护的亚磷酰胺核苷的 3’磷酸基团与固定在载体上的核苷酸的 5’末端羟基酯化偶联，实现逐步合成。
10.PCR 反应的基本步骤是（）、（）、（），PCR 反应的第（）
个循环才第一次出现正确的双链复制片段
11.聚丙烯酰胺凝胶电泳兼具（）和（），分辨率可以达到 1bp。
12.DNA marker 有 2 种，1 种是病毒等 DNA 经（）获得的，分子量大小有零有整，另外一种使固定
数值的，如 100bp,200bp 等。
13.紫外灯下切胶时间过长会导致 DNA 部分降解，应尽量把切胶时间控制在（）以内。
14.克隆载体是一类可以供外源 DNA 插入并携带重组 DNA 分子进入适当宿主细胞的 DNA 分子：
15.克隆载体包括至少 1 个复制起点至少 1 个，至少（）。
16.表达载体相对克隆载体多了（）、（）、（）。
17.遗传标记基因分为（），如 Ampr（; ）,如 URA3、His4、Trp1 等，（），
如 lacZ。
18.表达载体按照序列来源分为（）、（）、（）。
19.质粒
20.按照复制性质，质粒型载体被分为（）：当细菌染色体复制 1 次时，质粒也复制 1 次，每个细胞
内只有 1 - 2 个质粒；（）：当染色体复制停止后仍能继续复制，每个细胞内约有 20 个左右质粒。
21.病毒型载体 cosmid:带有λ噬菌体 1-2 个 cos 位点，通过 cos 位点控制噬菌体颗粒的包装，利用 cos 位点解决质粒
包装大小的问题。DNA 克隆进入质粒，通过噬菌体颗粒将 DNA 注入大肠杆菌细胞，能够像质粒一样增殖。
22.穿梭载体不仅具有细菌质粒的复制起点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性
状，具有多克隆位点。在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表达分析。
作业：请阐述 PCR 的原理，基本步骤和注意事项
基因工程实验技术 -2
1.DNA 连接酶借助 ATP 或 NAD 水解提供的能量催化 DNA 链的 5’-PO4 与另一 DNA 链的 3’-OH 生成磷酸二酯键。
DNA 聚合酶的连接温度是 16℃，然而保持连接酶活性的最适温度是 37℃？其原因是？
2.DNA 连接酶连接时，外源片段浓度应该比质粒载体 DNA 浓度高（），为了防止质粒载体环化，
常常采用（）酶预先处理质粒。
3.确定重组载体 DNA 序列的正确性采用 DNA 测序技术，第一代测序技术有（）和（）。
4.末端合成终止法 sanger 法的原理：
在 4 组独立体系中进行分别含有 4 种 dNTP，并各自混有 1 种不同的 ddNTP，链延伸将与偶然发生但十分特异
的链终止竞争，产生一组寡核苷酸，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，处理后可以采用发射自显影的方法进行检测，
如果 ddNTP 各自偶联上不同发射波长荧光基团，可以在同一体系下进行将光波长信号转化为电信号。
5.二代测序技术 illumina 测序法的基本原理
（1）建库：将基因组打断成 300 - 500 bp 的长度，采用酶补平末端，在 3’端加工特异的碱基 A，利用碱基互补配
对原则，加上接头 adapter。
（2）桥式 PCR 扩增：将 DNA 样品调整至合适浓度加入到 flowcell 中，序列的一端通过化学键与 flowcell 上的短序
列连接，采用桥式 PCR，形成 DNA 簇
（3）测序：通过边合成边测序的原理，加入改造的 DNA 聚合酶和 4 种荧光标记的 dNTP,3’末端被叠氮基团修饰，1
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次合成后将多余的 dNTP 和 ATP 洗掉，根据发出的荧光读取加入的碱基，加入化学试剂切割 3’叠氮基团和荧光基
团，3’-OH 暴露，进行下一轮测序。
6.三代测序技术是（单分子测序技术），不经过 PCR 扩增反应，实现了对一条 DNA 分子的单独测序，主要技术
有 PacBio 的（）技术和 Oxford 的（）技术。
7.四代 DNA 测序技术基于（）和原子力显微镜，通过极小的镀银玻璃极头扫描核酸片段，激发独
特的（），最终将光谱转换为核酸序列；还可以依靠快速扫描隧道电子显微镜技术，单个 DNA 碱
基被标以独特的重原子，使得它们彼此区分开来。
8.DNA 测序技术的应用：（ 1 ）、（2 ）、（3 ）、（4 ）、
（5 ）。
9.转化是针对细菌（肺炎双球菌转化实验）而言的，用的是（）载体；转染是用（）作载体，无衣
壳；转导是用（），衣壳体外包装。
10.转化（transformation）：
11.感受态细胞最基本的要求：（）、（）、（）。制备感受态细胞
时，OD600 值要在（）之间，空白用无菌体 LB 培养基。
11.转染（transinfection）：重组的病毒 DNA 进入细胞进而完成复制和繁殖的过程称为转染。
转导：指一个细菌的 DNA 或 RNA 通过病毒载体的感染转移到另外一个细胞中。转导是指通过病毒将一个宿主
的 DNA 转移到另一个宿主的细胞中而引起的基因重组现象。如果供体 DNA 未与受体 DNA 发生重组则称此转导过
程为流产转导。
12.检测目的基因是否转入宿主细胞的方法有哪些？
（1）蓝白斑筛选：外源 DNA 片段插入后会破坏 MCS 与菌株编码的 lacZ 的 C 端部分序列形成的α互补，因此如果
外源 DNA 片段没有插入质粒，在 IPTG 诱导下，互补的β-半乳糖苷酶可以分解无色底物 X-gal，形成蓝色菌落；如
果外源基因片段插入，阅读框被破坏，不能分解培养基中的 X-gal，因此重组质粒在培养基表现为白色菌落。
（2）Southern:具有一定同源性的 2 条核酸单链在一定条件下，可以特异性地互补为双链，变性 DNA，转移至尼龙
膜上，与标记的核酸探针杂交，放射自显影或酶反应显色，可以测定目标 DNA 分子的存在和含量。
（3）Northern:检测目的基因是否转录，裂解表达菌株、冷酸法提取 RNA，选择内切酶处理 RNA 并电泳，转膜、
杂交、显影
（4）Western:SDS-PAGE 电泳、转膜、显色或者 SDS-PAGE 切胶后进行肽指纹图谱测序确定是否为目标蛋白。
13.肽质量指纹图谱：是一种蛋白质鉴定技术，利用质谱技术测定蛋白质水解肽片段的质量，然后通过将测定的肽质
量与来自蛋白质/核酸序列数据库的相应肽质量作比对来识别蛋白质，是蛋白质组学研究分析的有效手段。
作业
1.简述 DNA-sequencing 的过去，现在和将来（原理和应用）
2. 请列举至少三种目的基因在受体细胞的检测和鉴定

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