原创 xiaoyudian 图灵基因 今天

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1、文章系统地介绍了4Pi-SMS系统的路径、性能及配置等情况，并通过改进进一步增强其震动稳定性和重复性，并缩短时间周期。
2、文章利用建立的4Pi-SMS系统，通过实际的应用阐述了从样品制备到获得全细胞图像和分析原始图像数据，建立超分辨率3D数据集的过程，并在此基础上，分析4Pi-SMS的优势与不足。

近日，来自英国、美国、中国和德国的研究人员Jingyu Wang等人合作在《Nature Protocols》上发表了一篇名为“Implementation of a 4Pi-SMS super-resolution microscope”的文章。文中详细介绍了4Pi-SMS仪器的光学机械组件的装配、光路校准和性能测试。该协议还提供了如何制备测试样品、操作该仪器以获取全细胞图像和分析原始图像数据以重建超分辨率3D数据集的说明。此外，还提供了故障排除指南，并给出了预期结果的示例。除此之外，生产周期也尽可能的降低，未来具有良好的推广和发展前景。

当前对于细胞及分子水平的研究，越来越受到显微镜分辨率的限制，传统的白光和激光共聚焦的光斑尺寸无法达到这样的分辨率，4Pi -SMS显微技术是一种超分辨率荧光成像技术，与SMLM相比，4Pi检测在XY方向的定位精度提高了一倍，Z轴方向的分辨率提高了近6倍。本研究中对于如何组装、测试和操作4Pi-SMS显微镜进行详细的说明。
研究中首先结合SMLM进行4Pi检测，采用干涉PALM (iPALM) 3个干涉通道，然后采用4个4Pi-SMS干涉通道。在这种方法中，通过将模型函数拟合到单分子图像上，利用传统的SMLM技术确定分子的横向XY位置。利用4Pi干涉效应，高精度地找到每个分子的轴向Z位置。为了达到所需的干涉对比度，两个光路之间的光程长度差必须在单个发射器的相干长度内，通常为5-10 µm。同时，在每个目标后，在每个光路中故意添加散光。由散光引起的点扩散函数(PSF)畸变允许分子的z-位置被分配到4Pi干涉图的一个峰上，从而消除了轴向定位的模糊性。通过引入像散的概念，采用自适应光学方法对PSF进行成形，并对随深度变化的样品像差进行校正。

图1显示了4Pi-SMS检测系统的光路图。荧光发射由两个相对的物镜(OBJ0和OBJ1)收集，然后定向到两个对称的，相同的上和下光束路径，各自的光束路径通过宽频消色差QWPs (QWP0和QWP1)，引入激发激光的二色镜(DI0和DI1)，两对透镜将物镜后瞳平面成像到DMs (DM0和DM1)上，并最终形成非偏振50/50分光镜多维数据集(NPBS)。

相对于发射路径，系统的激发装置安装在垂直面板的另一侧，如图2所示。图1b中给出了激发路径的光学布局。激发光通过单模保偏光纤传输到系统。从光纤发射的光经过准直，并沿着一条直线通过一个矩形光圈，然后一个透镜将激发光聚焦到OBJ1的后光圈。矩形孔径用于限制样品处的照明面积，从而避免了未成像区域的不必要的光漂白，并减少了来自自发荧光和散射的背景。光束尺寸、光圈尺寸和聚焦透镜的选择使样品得到更均匀的照明。激发路径还包括两个倒装镜，可以引导激发光束通过另一个路径，从而在样品处形成一个大的照明区域，用于样品定位和识别。
此外，激发路径包括用于实时目标对准的近红外激光束(LS1，图1b)。近红外光束从一根光纤发射出来，相对于激发光沿相反的方向传播，然后被二向色镜分离，定向到摄像机(CAM1)上。柱面镜头(CY0)在近红外光束路径增加散光之前聚焦到相机。目标的相对横向位置可以通过观察摄像机上的聚焦点来跟踪。柱面透镜所引入的散光能够跟踪目标的轴向位置。从这个相机的图像是用来纠正目标位置通过闭环控制。
研究者利用市场上可获得的光学机械部件构建该系统，同时从振动稳定性，重复性和便捷性三个方面对其进行反复的实验和改进。在应用的过程中，发现该系统具有显著的3D各向分辨率，能够在细胞生物学中国提供接近于电子显微镜的免疫荧光标记特异性的三维分辨率；此外，可以很容易地添加多色成像，并且与使用探针切换的任何基于定位的方法进行兼容；该系统还允许使用自适应光学对整个细胞的厚度进行成像；稳定性较好，且后期校准维护相对简单。同时，也存在着局限性，系统的低时间分辨率排除了活细胞成像的可能性，限制了样品的物理空间。总的来说，这个系统是一个优秀的选择，对于应用程序，能够提供需要的卓越的3D分辨率。教授介绍

Joerg Bewersdorf，美国耶鲁大学医学院教授，细胞生物学与生物医学工程教授。长期以来一直在超分辨率光领域做出贡献显微镜的发展以及这些技术在细胞生物学问题中的应用。
当前实验室开发了超高分辨率的STED显微镜，单分子定位显微镜（FPALM / PALM / STORM / PAINT等）和泛扩展显微镜（pan-ExM）技术。该团队正在积极开发以提高这些成像技术的功能（速率、3D分辨率、稳定性、多色标记），扩大超分辨率显微镜的应用范围，并尝试将它们应用于一系列生物学问题。目前已在Nature子刊等杂志发表了多篇高影响力的论文。参考文献
Wang, J., Allgeyer, E.S., Sirinakis, G. et al. Implementation of a 4Pi-SMSsuper-resolution microscope. Nat Protoc (2020).https://doi.org/10.1038/s41596-020-00428-7.