2019年，加拿大滑铁卢大学刘珏文团队在Angewa杂志发表文章“DNA寡核苷酸的冷冻定向拉伸和排列”。研究发现冷冻可以拉伸DNA，并且核酸链与核酸链之间的侧向相互作用起重要作用，拉伸DNA寡核苷酸排列。同时冷冻可以使DNA寡核苷酸很容易的吸附在纳米材料上，通过稳定的热力学构象，导致更稳定共轭配合。

具有识别和催化作用的DNA分子(aptamers, DNAzymes, DNA hybridization probes)一般以典型的单链形式存在，但是单链DNA的长度仅仅是几个碱基的长度(小于1nm)，因此控制单链DNA的构象是非常困难的问题。作者为了监测单链DNA的构象采用冷冻的方法，并首先通过FRET证明。30-mer的随机核酸序列两端分别标记Cy3和Cy5，其中Cy3黄色发射是FRET的供体，Cy5红色发射是FRET的受体。在低盐条件下，溶液呈现黄色荧光，说明发射主要来自Cy3，DNA是一个舒展的状态，FRET发射概率低。随着盐浓度的增加，发射逐渐转变成红色，这是由于盐的加入降低了DNA分子间的电荷排斥作用，压缩了DNA，提高了FRET的效率(图1a)。而上述不同盐浓度的核酸溶液经冷冻快速成像，可以发现所用的样品呈现红色荧光。这是由于冷冻使盐和核酸得到浓缩，增加了FRET效率(图1c)。向溶液中加入200倍的非标记30mer的随机核酸序列使得标记的DNA直接相互作用最小化，冷冻之前FRET依赖盐浓度的影响时非常小的，而冷冻之后发现所有的样品与盐浓度无关都呈现黄色，这是由于冷冻拉伸了DNA(图1d)。

上述的FRET是通过共价标记荧光基团进行的，为了排除标记的干扰，选择甲基橙染料进行实验。其中甲基橙和DNA的量子产率顺序是quadruplex>dsDNA>ssDNA。以此为基础进行实验，在室温条件下G15显示最高的荧光，冷冻之后A15同样显示出较强的荧光，这可能是由于冷冻使得polyA按照有序的结构进行排列(图2)。因为在酸性条件下polyA是以平行双链的形式存在，所以推测冷冻的排列结构可以能与其类似。

图1. 通过FRET证明探针DNA1的构象

图2. 通过TO染色证明探针DNA的构象

为了证明polyA的排列方式首先证明形成荧光的polyA的最低组成碱基个数，由图2c可知，在AMP的冷冻条件下就有微弱的荧光，随着碱基个数的增加，荧光逐渐增加，当碱基个数达到15时，荧光呈现饱和状态。所以排列方式应该是链间的相互作用，而不是末端的相互堆叠。同时图2b中polyC和polyT冷冻后也没有荧光，这可能是由TO不能对其进行染色所致，因此在序列的两端加上带有A的帽子，结果如图2c所示，证明polyT在冷冻状态下也是按照某种特定排列方式进行排列的。

同时为了测量DNA在冷冻状态下的排列数量，选择两种不互补的长12mer的DNA进行实验，一种标记荧光基团，一种标记猝灭基团。如果一种类似双螺旋的复合体形成荧光会猝灭1/6左右，图3a结果显示当DNA以1:1的比例加入到反应体系中荧光猝灭在60%左右，因此证明在冷冻状态下超过两条链之间相互结合(图3c)。

图3. a)两种非互补DNA的可能排列；b) 在冷冻状态下通过FAM-12-DNA和不同比例的Q-12DNA的荧光比例；c) 显示DNA在多聚体中排列的机制；d) 显示DNA模板形成AuNPs的机制和在冰上TEM成像e)，在溶液中成像f)；g) DNA-PEI复合物的机制和TEM成像，在冰上h),在溶液中i)

为了获得更直接的TEM成像，首先解决了在冰上成像短DNA序列的难题，文中通过两种方法，一种是通过ssDNA与HAuCl4在冰上原位形成AuNPs，另一种是通过PEI与DNA形成复合物，两种方法都获得了较好的实验结果，更加直观的证明了寡核苷酸链在冷冻状态下有序排列。

同时DNA功能化的纳米材料在生物传感发展、直接组装和药物递送过程中是最重要的试剂。当DNA与纳米材料表面相互作用时，DNA的吸附构象可能不是最稳定的热力学状态，因此DNA的构象可能极大的影响吸附状态，进而反过来会影响吸附DNA的强度、稳定性和活性。因此将拉伸单链DNA使得他们的吸附更一致，共轭配合的能力更高是非常有意义的事情。因此本文选取四种代表性的纳米材料，研究冷冻对于他们的吸附产生的影响。由图4b可知四种纳米材料都是阴性纳米材料自身基本不能吸附DNA，但是在高盐条件下可以中和掉DNA骨架上的阴离子使得DNA易于吸附在纳米材料上，低盐冷冻状态下同样可以使DNA吸附在纳米材料上(图4c)。同时图4d表明经冷冻后链接上核酸序列之，再溶解纳米材料的稳定性良好。接下来以DNA/GO为实例进行验证，FAM DNA/GO首先准备通过300mM的NaCl和无盐冷冻的两种方式进行交联。然后用相同的没有标记的DNA置换FAM DNA。通过冷冻制备的样品置换速率是更缓慢的(图4e)，证明冷冻的吸附能力是更强的。这些结果均表明拉伸的DNA在冷冻定向吸附时保持其构象，并且更多的核碱基可与GO表面相互作用。

图4. a) 冷冻调控DNA吸附；b)纳米材料的ξ电势；c) 没有盐的DNA吸附能力，300mM NaCl的的吸附能力，以及无盐冷冻状态下的吸附能力； d) 纳米材料在冷冻后溶解的稳定性展示； e) 通过添加相同的DNA但不含FAM标记(500nM)从GO(10ug/mL)置换FAM-DNA(50nM)的动力学

点评：

1.文中提出冷冻调控DNA寡核苷酸的拉伸和排列的观点，并且通过FRET，染料法和表面增强拉曼光谱成像等多方面证明，其实验结论真实可信。

2.其中在冷冻状态下对短核酸链的染色方法值得学习借鉴，并且解决了TEM成像困难的难题，使推测的冷冻拉伸、排列的结论更直观、准确的得到验证。

3.纳米材料与功能核酸的结合目前已经在生物传感、药物的递送、体内成像等方面广泛应用，文中提出冷冻可以提高其结合能力，并且拉伸构象，使其均一排列，这种方法可以解决核酸与纳米材料吸附不稳定、构象变化复杂等问题。

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Liu, B., Wu, T., Huang, Z., Liu, Y., & Liu, J. (2019). Freezing‐directed Stretching and Alignment of DNA Oligonucleotides. Angewandte Chemie, 131(7), 2131-2135.