Cell论文解读！新研究揭示CRISPR/Cas9除了作为基因编辑工具，还可作为调节开关调节基因活性

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在一系列针对实验室培养的细菌开展的实验中，来自美国约翰霍普金斯大学的研究人员发现了证据，表明广泛使用的基因切割系统CRISPR-Cas9还有另一种作用---作为CRISPR-Cas9基因的自我调节开关。它调低或调弱CRISPR-Cas9活性的作用，可能会帮助科学家们开发出用于研究目的的细胞基因工程新方法。相关研究结果于2021年1月8日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“A natural single-guide RNA repurposes Cas9 to autoregulate CRISPR-Cas expression”。

图片来自Cell, 2021, doi:10.1016/j.cell.2020.12.017。

CRISPR-Cas9于1987年首次在肠道细菌的基因组中被发现，它是一组天然存在但不寻常的基因，具有切割其他类型细胞中DNA序列的潜力，这种能力在25年后才得以实现。它在基因工程中的价值---在包括人体细胞在内的活细胞中诱导可编程的基因变化---迅速得到了人们的认可。它作为基因组“编辑器”在全球数千个实验室中得到广泛应用。

CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称。Cas9，指的是CRISPR相关蛋白9，是进行DNA切割的酶的名字。论文通讯作者、约翰霍普金斯大学医学院分子生物学与遗传学助理教授Joshua Modell博士说，细菌天然地使用CRISPR-Cas9来切割病毒或其他潜在有害的DNA并使这种威胁失效。Modell说，就这种作用而言，“CRISPR不仅是一种免疫系统，而且还是一种适应性免疫系统---它可以通过保留病毒的一小段DNA来记住以前遇到过的威胁，这类似于罪犯的面部照片。”这些面部照片随后被复制到“向导RNA（gRNA）”中，告诉Cas9切割什么。

科学家们长期以来一直致力于解开CRISPR-Cas9作用机制的精确步骤，以及它在细菌中的活性如何被调高或调低。这些研究人员在寻找激活或抑制酿脓链球菌CRISPR-Cas9基因切割系统的基因时，发现了这一系统如何运作的线索。

具体来说，这些研究人员在CRISPR-Cas9系统中发现了一个基因，当失活后，它会导致这种基因编辑系统在细菌中的活性急剧增加。这个基因的产物似乎是对Cas9进行重新编程，使其作为刹车（brake）起作用，而不是“剪刀”，以调低CRISPR系统的活性。

论文共同第一作者、Modell实验室研究生Rachael Workman说，“从免疫的角度来看，细菌需要提升CRISPR-Cas9的活性，以识别和摆脱细胞经历的威胁，但它们也需要将调低这种系统的活性，以避免自身免疫---当免疫系统错误地攻击细菌本身的成分时，这种情形就会发生。”

为了进一步确定这种“刹车”的特殊性，Modell及其研究团队的下一步是更好地了解失活基因（tracrRNA）的产物。RNA是由DNA转录而来，对执行DNA制造蛋白的“指令”至关重要。TracrRNA属于一个独特的不制造蛋白的RNA家族。相反，它们作为一种支架，使Cas9酶能够携带含有罪犯面部照片的gRNA，并在入侵的病毒中切割匹配的DNA序列。

TracrRNA有两种大小：长和短。大多数现代基因切割工具CRISPR-Cas9都使用短的tracrRNA形式。然而，Modell团队发现，这种失活的基因产物是长形式的tracrRNA，其功能一直完全未知。

长形式的tracrRNA和短形式的tracrRNA在结构上相似，共同点是能够与Cas9结合。短形式的tracrRNA也能与gRNA结合。然而，长形式的tracrRNA不需要与gRNA结合，这是因为它包含一个模拟gRNA的片段。Modell说，“本质上，长形式的tracrRNA结合了短形式的tracrRNA和gRNA的功能。”

此外，这些研究人员还发现，gRNA通常会寻找病毒DNA序列，而长形式的tracrRNA靶向CRISPR-Cas9系统本身。长形式的tracrRNA倾向于停靠在DNA上，而不是切割它。当这种情况发生在一个基因的特定区域时，它就会阻止该基因的表达，或者说阻止该基因成为功能性的基因。

为了证实这一点，这些研究人员通过基因工程手段改变了长形式的tracrRNA中某一区域的长度，使得tracrRNA看起来更像gRNA。他们发现，在改变了长形式的tracrRNA后，Cas9再次表现得更像一把剪刀。

其他实验表明，在实验室生长的细菌中，如果有大量的长形式tracrRNA，所有CRISPR相关基因的水平都非常低。但当从细菌中去除长形式tracrRNA时，CRISPR-Cas9基因的表达量却增加了百倍。

将缺乏长形式tracrRNA的细菌细胞在实验室中培养3天，并与含有长形式tracrRNA的类似培养细胞进行比较。实验结束时，没有长形式tracrRNA的细菌已经完全死亡，这说明长形式tracrRNA通常可以保护细胞免受CRISPR-Cas9活性非常高时发生的病变和死亡。

Workman说，“我们开始有这样的想法，即长形式tracrRNA抑制但并没有消除它自身的CRISPR相关活性。”

为了观察长形式的tracrRNA是否可以被重新编程以抑制其他细菌基因，这些研究人员改变了长形式tracrRNA的间隔序列区，让它停靠在一个产生绿色荧光的基因上。与含有正常的长形式tracrRNA的细菌相比，具有这种突变版本的长形式tracrRNA的细菌发出的绿色荧光更少，这表明长形式tracrRNA可以通过基因工程来调低其他的细菌基因。

另一个来自埃默里大学的研究团队已发现，在寄生的新凶手弗朗西丝菌（Francisella novicida）中，Cas9可作为CRISPR-Cas9区域外基因的调节开关起作用。在这项新的研究中，虽然CRISPR-Cas9系统作为一种基因切割工具被科学家们更广泛地使用，但是Modell团队的研究结果提供了证据表明这种调节开关除了控制CRISPR-Cas9系统外，还控制了其他基因。

这些研究人员还在约40%的链球菌属细菌中发现了长形式tracrRNA的遗传成分。Workman说，对不具备长形式tracrRNA的细菌菌株的进一步研究，将有可能揭示它们的CRISPR-Cas9系统是否完好无损，以及这些细菌可能调节CRISPR-Cas9系统的其他方式。

Modell说，这些实验所发现的调节能力，为设计新的或更好的CRISPR-Cas9工具提供了机会，以便调节基因活性。他说，“在基因编辑方案中，科学家们除了使用长形式的tracrRNA来抑制基因活性外，还可能希望切割特定的基因。”（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

1.Rachael E. Workman et al. A natural single-guide RNA repurposes Cas9 to autoregulate CRISPR-Cas expression. Cell, 2021, doi:10.1016/j.cell.2020.12.017.

2.CRISPR technology shown to dial down gene activity in bacteria
https://phys.org/news/2021-01-crispr-technology-shown-dial-gene.html

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