用荧光素酶基因标记肿瘤细胞的实验步骤
哺乳动物生物发光，一般是将Firefly luciferase基因（由554个氨基酸构成，约50KD）即荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光素酶也会得到持续稳定的表达。将标记好的细胞接种到实验动物体内后，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP，氧存在的条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。
采用慢病毒表达系统GFP（mCherry）和Luciferase2双标记表达细胞系，通过2A序列连接GFP（mCherry）和Luciferase2，可同时等量表达GFP（mCherry）和Luciferase2，便于体外观察和体内示踪；mCherry可用于体内示踪，与新一代Luciferase2结合，可方便的监测细胞在体内的生长和变化。
转染方法与标记过程的描述（慢病毒转染Hygromycin筛选）：
(一) 质粒部分
1.酶切载体：pGL4.10（luc2）由酶切获得1400bp的luc2基因片断；EGFP和mCherry片段由PCR扩增获得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A载体酶切线性化。
2.电泳和胶回收：上述酶切产物DNA电泳， TAKARA试剂盒胶回收，回收产物取少量电泳鉴定。
3.连接载体与目的片段:使用Invitrogen T4连接酶连接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A线性化载体，连接使用20ul体系，25℃，10min。
4.转化：感受态菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入连接产物，静置25min后在水浴42℃，45sec热休克，后加入250ul无抗培养基225转摇菌1h，将转化的菌铺于有氨苄抗性平板37度过夜。
5.挑取单克隆：观察平板后挑取15个单克隆至含2ml氨苄抗性 LB培养基摇菌管中，255转摇菌6.5h。
6.小抽质粒与鉴定：使用碱裂解法小抽，质粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鉴定: 重组质粒用通过酶切鉴定。
7.荧光素表达鉴定: 重组质粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下简称Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下简称Mluc） 转染293T细胞：DNA定量后，使用PEI转染Gluc或Mluc至24孔板已预铺的293T细胞中。转染采用脂质体法转染，试剂采用JetPEI (Polyplus公司)。两管EP管中分别加入50ul生理盐水，其中一管加入1ug量的质粒（DNA体积=1ug/DNA浓度），轻轻震荡混匀，再轻微离心；在另一管中加入PEI 2ul轻轻震荡混匀，轻微离心，然后把PEI管中的溶液加入含有的质粒管中，室温孵育20min。将脂质体包绕DNA的混合液加入需要转染的24孔内，37 ℃、5 % CO2条件下培养，8小时后换培养液。
8.报告基因检测：Passive Lysis Agent裂解细胞，加入荧光素酶作用底物，将转染质粒的细胞与阴性，阳性对照共同进行单报告基因检测。
9.质粒中抽：取1ml转染报告基因检测正确的菌液加入100ml氨苄抗性的LB培养基中摇菌过夜，使用Invitrogen试剂盒中抽，产物电泳鉴定，－20℃保存。
(二) 慢病毒包装部分
1. 质粒共转染细胞：转染前一天， 293T在10cm培养盘中的细胞达到90％，胰酶消化后，1：3传入新10cm培养盘中。转染时，细胞在培养盘中密度达到80％。采用脂质体PEI转染法使编码慢病毒包膜蛋白的质粒VSV G, Packaging Mix以及构建的Gluc或Mluc质粒15µg共转染。6h后换新鲜DMEM培养基。
2．提取病毒上清：转染48-72hours后，将含有病毒液的培养基转移到15ml离心管中,在低温4摄氏度条件下，3000rpm，离心10min去除片状沉淀的细胞碎片。
3．浓缩病毒：将病毒上清用0.45um滤器过滤至浓缩离心管中，2000rpm，4℃，15min离心。浓缩液收集于500µl离心管中，-80℃保存。
(三) 慢病毒感染&筛选
1.感染前一天(Day1)，消化目的细胞并计数，将细胞铺于24孔板中（以便在感染前细胞达到30%-50%的汇合度），37°C过夜孵化细胞。
2.(Day2) 解冻低温保存的慢病毒液，并且制备1：2病毒稀释液200µl加入细胞中。
3.向每孔加入Polybrene达到终浓度6ug/ml，晃匀孔板，37度孵化过夜。
4.(Day3)移去含有慢病毒的培养基，加入500µl完全培养基。
5.(Day4)换液，加入300µg/ml Hygromycin（Sigma）来选择稳定感染的细胞克隆。
6.(Day4－7），每24h换液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）来选择稳定感染的细胞克隆。
维持培养。
7.(Day8－12）细胞逐渐由24孔板传入6孔板、6cm盘和10cm盘中100µg/mlHygromycin维持培养。
8. 目的细胞-Gluc/Mluc细胞系鉴定: 取5×104细胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入荧光素酶作用底物，将转染质粒的细胞与阴性，阳性对照共同进行单报告基因检测。GFP和mCherry表达通过荧光显微镜观察。
小鼠活体成像是科学研究和药物研发的常用方法。进行此实验的前提是必须要有能稳定表达发光基因的细胞。常用的发光基因包括萤火虫萤光素酶（firefly luciferase，Fluc）、绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（tdTomato）。本部分汇集了几种常用的稳定转染了Fluc的癌细胞系，并从Fluc、GFP、tdTomato转基因动物体内分离得到了发光的免疫细胞。这些细胞是进行基础研究和药物研发的常用工具。
》点击蓝字可查看详情
| 分类 | 产品描述 | 单位 | 包装量 |
| 发光原代细胞 | Fluc阳性原代小鼠CD4+ T细胞 | 支 | 2.00E+06 |
| Fluc阳性原代小鼠CD8+ T细胞 | 支 | 2.00E+06 | |
| Fluc阳性原代小鼠B细胞 | 支 | 2.00E+06 | |
| Fluc阳性原代小鼠NK细胞 | 支 | 2.00E+06 | |
| Fluc阳性原代小鼠CD11c+骨髓来源DC细胞 | 支 | 5.00E+06 | |
| Fluc阳性原代小鼠骨髓来源巨噬细胞 | 支 | 5.00E+06 | |
| GFP阳性原代小鼠CD4+ T细胞 | 支 | 2.00E+06 | |
| GFP阳性原代小鼠CD8+ T细胞 | 支 | 2.00E+06 | |
| GFP阳性原代小鼠B细胞 | 支 | 2.00E+06 | |
| GFP阳性原代小鼠NK细胞 | 支 | 2.00E+06 | |
| GFP阳性原代小鼠CD11c+骨髓来源DC细胞 | 支 | 5.00E+06 | |
| GFP阳性原代小鼠骨髓来源巨噬细胞 | 支 | 5.00E+06 | |
| tdTomato阳性原代小鼠CD4+ T细胞 | 支 | 2.00E+06 | |
| tdTomato阳性原代小鼠CD8+ T细胞 | 支 | 2.00E+06 | |
| tdTomato阳性原代小鼠B细胞 | 支 | 2.00E+06 | |
| tdTomato阳性原代小鼠NK细胞 | 支 | 2.00E+06 | |
| tdTomato阳性原代小鼠CD11c+骨髓来源DC细胞 | 支 | 5.00E+06 | |
| tdTomato阳性原代小鼠骨髓来源巨噬细胞 | 支 | 5.00E+06 | |
| 发光细胞系 | Fluc阳性人髓性白血病细胞株KG-1 | 支 | 1.00E+06 |
| Fluc阳性人淋巴瘤细胞系Raji | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人红白血病细胞系K562 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人肺癌细胞系A549 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人乳腺癌细胞系4T-1 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人肝癌细胞系HepG2 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人大细胞肺癌细胞系NCI-H460 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人大细胞肺癌细胞系NCI-H661 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人肺癌细胞系A-427 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人肝癌细胞系Hep 3B2.1-7 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人宫颈癌细胞系HeLa | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人宫颈癌细胞系SiHa | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人骨肉瘤细胞系MG-63 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人成骨肉瘤细胞系Saos-2 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人成骨肉瘤细胞系U-2 OS | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞系RD | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性小鼠成肌细胞系C2C12 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人结直肠癌细胞系HCT 116 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人结肠腺癌肺转移细胞系T84 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人结直肠腺癌细胞系Caco-2 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人结肠癌细胞系COLO 205 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人结直肠腺癌上皮细胞系DLD-1 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人结肠癌细胞系HT-29 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人结肠癌细胞系SW480 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人结肠腺癌细胞系LS 174T | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人结肠癌细胞系RKO | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人纤维肉瘤细胞系HT-1080 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系RAW 264.7 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人B淋巴细胞瘤细胞系Ramos | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人套细胞淋巴瘤细胞系Mino | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人套细胞淋巴瘤细胞系JeKo-1 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人套细胞淋巴瘤细胞系REC1 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人B细胞淋巴瘤细胞系SU-DHL-6 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人组织淋巴瘤细胞系U-937 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人卵巢癌细胞系SK-OV-3 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人神经胶质瘤细胞系U-87 MG | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人脑胶质瘤细胞系T98G | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人恶性黑色素瘤细胞系A-375 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人皮肤鳞癌细胞系A-431 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人皮肤成纤维细胞Hs 865.Sk | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人前列腺癌细胞系DU 145 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人前列腺癌细胞系LNCaP clone FGC | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人前列腺癌细胞系PC-3 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人乳腺癌细胞系MCF7 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人乳腺癌细胞系MDA-MB-468 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人正常乳腺上皮细胞系MCF 10A | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人乳腺腺癌细胞系SK-BR-3 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人乳腺导管癌细胞系T-47D | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC-12 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人急性淋巴细胞白血病细胞系CCRF-CEM | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人Burkitt's淋巴瘤细胞系Daudi | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人急性早幼粒细胞白血病细胞系HL-60 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人急性淋巴细胞白血病细胞系MOLT-4 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人急性单核细胞白血病THP-1 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人套细胞淋巴瘤细胞系JVM2 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人胃腺癌细胞系AGS | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人胃癌细胞系SNU-16 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人胰腺癌细胞系PANC-1 | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性大鼠胰岛β细胞肿瘤细胞系RIN-5F | 支 | 1.00E+06 | |
| Fluc阳性人宫颈癌细胞系HeLa S3 | 支 | 1.00E+06 |
用荧光素酶基因标记肿瘤细胞的实验步骤相关推荐
- 荧光标记肿瘤细胞解决方案
活体成像是科学研究和药物研发的常用方法.进行此实验的前提是必须要有能稳定表达发光基因的细胞.常用的发光基因包括萤火虫萤光素酶(firefly luciferase,Fluc).绿色荧光蛋白(GFP). ...
- 活体生物发光成像技术原理及应用
一.技术原理 1. 标记原理 哺乳动物生物发光,一般是将 Firefly luciferase 基因(由 554 个氨基酸构成,约 50KD)即荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体 DNA 上以表达 ...
- 小鼠的活体成像肿瘤模型的建立
体内可见光成像(optical in vivo imaging)技术 主要包括 生物发光(bioluminescence) 与 荧光(fluorescence)成像 两种技术.生物发光成像是用 荧光素 ...
- 肿瘤细胞通过RB1CC1介导的转录重编程对铁死亡敏感
在癌症领域研究中,铁死亡是一种受调节的细胞死亡形式,使肿瘤细胞对铁死亡敏感的信号通路和因素未探究清楚.触发铁死亡可以有效地治疗对促凋亡和其他常规抗肿瘤治疗耐药的肿瘤细胞.因此,全面研究信号网络和引起铁 ...
- 荧光标记肿瘤细胞-让肿瘤细胞无处遁形
在科普今天的知识前,不禁让小编回忆起大学校园的美好时光,那个时候小编还是个走在绿树荫下的青涩少年啊,在一次参加关于肿瘤免疫学的学术会议上,看到了类似下面这种图,我就在想,这小鼠是修炼了什么内家功法,被 ...
- oracle datafile损坏,史上最全Oracle文件损坏处理办法(附实验步骤)
一.概述本文将给大家介绍oracle各类文件损坏的现象和应对策略,请注意所有的恢复都是基于有备份的情况,所以请开启数据库的日常备份. 文章将从以下文件展开:a. 密码文件b. 参数文件c. 控制文件d ...
- miRNA实验与荧光素酶
miRNA对靶基因的调控是否真正的存在,最常用的方法就是荧光素酶报告基因. 荧光素酶 荧光素酶(luciferase,Luc)是指能催化不同底物(如荧光素.腔肠素等)发生氧化使其发射出荧光的一类酶的总 ...
- 史上最全Oracle文件损坏处理办法(附实验步骤)
一.概述 本文将给大家介绍oracle各类文件损坏的现象和应对策略,请注意所有的恢复都是基于有备份的情况,所以请开启数据库的日常备份. 文章将从以下文件展开: a. 密码文件 b. 参数文件 c. 控 ...
- 从入门到入土：[SEED-Lab]-幽灵攻击|Spectre Attack Lab|详细说明|实验步骤|实验截图
此博客仅用于记录个人学习进度,学识浅薄,若有错误观点欢迎评论区指出.欢迎各位前来交流.(部分材料来源网络,若有侵权,立即删除) 本人博客所有文章纯属学习之用,不涉及商业利益.不合适引用,自当删除! 若 ...
最新文章
- Cesium官方教程8-- 几何体和外观效果
- 工作单元php,PHP面向对象之工作单元
- 建议收藏，详细篇 PyCharm 完美教程
- 新版：全世界最前沿的125科学问题
- 通向KDE4之路（十一）：Amarok2开辟起步
- c# key event
- NodeJs和ReactJs单元测试工具——Jest
- DBeaverUE for Mac(数据库管理软件)旗舰版
- 42pinQFN芯片焊接总结
- Wireshark 捕捉本地数据 --WinPcap切换NPcap
- Java随笔-线程stop与interrupt
- JavaScript 的防抖与节流
- 举些例子看看一个程序员的水平究竟可以差到什么程度？
- WIn10编译Audacity——C++
- 修改win7的登录界面背景与关机背景
- 机器人导航技术的研究现状和发展趋势
- 深拷贝和完全拷贝对比的探究
- Echarts：10-7-4:混合图（降水量蒸发量平均温度）
- android的实现关注好友功能,android仿微信好友列表功能
- 用美图秀秀批量等比处理图片宽度
热门文章
- python聊天室设计_如何使用 Python 开发一个聊天室？
- css3八卦,CSS3 阴阳八卦（太极）图动画
- 文字图片滚动 jquery 实现代码
- python——今天是第几天
- 二阶混合偏导数连续则相等的证明
- Mac虚拟机VMware Fusion如何强制关机虚拟系统
- 关于程序员的非技术面试题全在这里。
- 小程序高级电商前端第1周走进Web全栈工程师一----小程序注册、开发工具推荐、《风袖》首页布局详尽分析、Webstorm开发小程序必配配置、mock数据...
- 239页11万字新型智慧城市运营中心IOC大数据平台建设方案
- Matter协议特性解析(一) 支持非Matter协议，私有协议，Matter Bridge技术分析