第一章绪论第二章蛋白质结构基础第三章蛋白质分子设计第四章蛋白质的修饰和表达第五章蛋白质理化性质的分析和鉴定第六章蛋白质工程的实际应用 蛋白质工程 蛋白质分子设计 基于天然蛋白质结构的分子设计蛋白质设计原理蛋白质设计中结构与功能关系的研究天然蛋白质剪接全新蛋白质设计蛋白质的从头设计 蛋白质设计的目的 为蛋白质工程提供指导性信息探索蛋白质的折叠机理 简单蛋白质建筑或骨架的从头设计是研究蛋白质相互作用的类型及本质的很好途径 为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律 蛋白质设计存在问题 设计的蛋白质与天然蛋白质相比缺乏结构的独特性极明显的功能优越性设计的蛋白质有正确的形貌 显著的二级结构及合理的热力学稳定性 但三级结构的确定性较差 按照改造部位的多寡分为三类 第一类为 小改 可通过定位突变或化学修饰来实现 第二类为 中改 对来源于不同蛋白的结构域进行拼接组装 第三类为 大改 即完全从头设计全新的蛋白质 denovodesign 蛋白质分子设计的分类 蛋白质的分子设计 可分为两个层次在已知立体结构基础上所进行的直接将立体结构信息与蛋白质的功能相关联的高层次的设计工作在未知立体结构的情形下借助于一级结构的序列信息及生物化学性质所进行的分子设计工作 蛋白质分子设计程序 蛋白质分子设计程序 各种蛋白质结构预测和分子设计程序按照蛋白质分子设计的层次分为序列分析 二级结构预测 同源蛋白质结构预测 蛋白质突变体结构预测 蛋白质的性能预测和蛋白质分子设计六个部分 蛋白质设计循环 第一节基于天然蛋白质结构的分子设计 蛋白质分子设计流程图 天然蛋白质 蛋白质晶体学 新蛋白质 蛋白质三维结构 结构与功能关系 蛋白质突变体设计及结构预测 几何优化及蛋白质动力学研究 结构分析与原先的结构比较 蛋白质合成定位突变 分离 纯化及表征 蛋白质结构预测 从数据库输入 蛋白质分子设计大致涉及的几个重要方面 蛋白质来源 真菌 细胞 动物蛋白质和植物蛋白质筛选以及纯化蛋白质需要测定它们的序列 三维结构 稳定性 催化活性等 蛋白质三维结构的判断 目前PDB ProteinDataBank 已收集数以万计个蛋白质晶体结构 但是通常蛋白质序列的数目比蛋白质三维结构的数目大100倍 1 对于已知三维结构的蛋白质 根据PDB中三维结构对蛋白质进行设计2 对于位置三维结构的蛋白质 如果PDB中没有收录又未见文献报道 我们需要通过蛋白质X射线晶体学及NMR方法测定蛋白质的三维结构 或者通过结构预测的方法构建该蛋白质三维结构模型 计算机模拟技术在蛋白质设计循环中占有重要位置 建立蛋白质三维结构模型 确立突变位点或区域以及预测突变后的蛋白质的结构与功能对蛋白质工程是至关重要的专一性突变产物是蛋白质设计成败的关键 一些新技术 如PCR及自动化技术的发展使各种类型的基因工程变得快速 容易 二 蛋白质设计原理 内核假设 所谓内核是指蛋白质在进化中保守的内部区域 在大多数情况 内核由氢键连接的二级结构单元组成 所有蛋白质内部都是密堆积 很少有空穴大到可以结合一个水分子或惰性气体 并且没有重叠 所有内部的氢键都是最大满足的 主链及侧链 疏水及亲水基团需要合理地分布在溶剂可及表面及不可及表面 在金属蛋白中 配位残基的替换要满足金属配位几何 符合正确的键长 键角及整体的几何 对于金属蛋白 大部分配基含有多于一个与金属作用或形成氢键的基团 其余形成围绕金属中心的氢键网络 这涉及与蛋白质主链 侧链或水分子的相互作用 最优的氨基酸侧链几何排列 结构及功能的专一性 形成独特的结构 独特的分子间相互作用是生物相互作用及反应的标志 蛋白质设计的目标及解决办法 设计目标 解决办法 热稳定性对氧化的稳定性对重金属的稳定性pH稳定性提高酶学性质 引入二硫桥 增加内氢键数目 改善内疏水堆积 增加表面盐桥把Cys转换为Ala或Ser 把Met转换为Gln Val Ile或Leu 把Trp转换为Phe或Tyr把Cys转换为Ala或Ser 把Met转换为Gln Val Ile或Leu替代表面羧基替换表面荷电基团His Cys以及Tyr的置换 内离子对的置换专一性的改变 增加逆转数 turnovernumber 改变酸碱度 蛋白质突变体设计步骤 1 以蛋白质的三维结构为基础 利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的氨基酸2 利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构3 预测的结构与原始的蛋白质结构比较 利用蛋白质结构 功能或功能 稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质 注意问题 A应确定蛋白质折叠敏感的区域 包括带有特殊扭角的氨基酸 盐桥 密堆积区等B应确定对功能非常重要的位置C考察剩余位置对所希望改变的影响D当进行互换或插入 删除残基是应考虑他们对结构特征的影响 如疏水堆积 侧链取向 氢键 盐桥等 三 蛋白质设计中的结构 功能关系研究 定位突变在蛋白质结构与功能关系研究中的作用突变蛋白质构象的探测 定位突变种类 插入一个或多个氨基酸残基删除一个或多个氨基酸残基替换或取代一个或多个氨基酸残基最大量的定位突变是在体外利用重组DNA技术或PCR方法 突变蛋白质结构的评估 溶解性热力学分析 射线晶体学及 谱园二色散方法单克隆抗体探测构象变化 蛋白质中功能残基的鉴定 1 根据已知结构信息确定功能残基2 突变实验方法鉴定功能残基随机突变和删除分析及连接片断扫描突变3 利用蛋白质同源性鉴定功能残基 天然蛋白质的剪裁 分子剪裁 指在对天然蛋白质的改造中替换1个肽段或1个结构域应用 抗体分子的改造 Rop 结构与功能的容忍度 蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的容忍度 即结构与功能关系有一定的稳健度Fersht等替换了Barnase的所有内核残基 结果表明23 的突变体保留了酶的活性Mathews及其合作者在溶菌酶内核中替换多至10个残基 实验证明多重取代的蛋白仍具有活性以及协同折叠这些结果说明不同的氨基序列具有相近的设计的结构 第二节全新蛋白质设计 特征 全新蛋白质设计是另一类蛋白质工程 合成具有特异结构与功能的新蛋白质 根据所希望的结构及功能设计蛋白质或多肽的氨基酸序列 蛋白质的全新设计 蛋白质结构的从头设计蛋白质功能的从头设计取得的进展 血红素结合蛋白 氧化还原活性蛋白质 DNA结合蛋白基于蛋白质的高分子材料 中心问题 设计一个具有稳定及独特的三维结构的序列克服的障碍 线性聚合链的构象熵采取的策略 1 使相互作用的强度与数目达到最大 理论基础 分析已知结构的天然蛋白质中的二级结构单元 2 通过共价交叉连接减小折叠的构象熵 一 蛋白质结构的从头设计 二级结构模块单元的自组装 优点 设计或合成都比较简单缺点 蛋白质的稳定性 熵较大 依赖浓度 结构的简单重复 螺旋设计使用的策略 p67 1 使用大的形成螺旋倾向性的残基 如亮氨酸 谷氨酸或赖氨酸等2 使用合适的集团去除端基电荷 防止与螺旋偶极不合适的电荷相互作用3 使用极化或荷电氨基酸引入稳定的氢键或在螺旋中相隔一圈残基间的离子相互作用4 使用在螺旋中相隔一圈的残基间疏水的范德华相互作用5 使用芳香 荷电 疏的相互作用 蛋白质从头设计的手段 配体诱导组装配位结合位点设计在结构中有几个相互作用片断的界面处 如果这个位点对配体有很高的亲和力 则结合配体的合适的自由能将充分克服熵消耗并且驱动肽自组装 通过共价交叉连接实现肽的自组装 设计全新蛋白的主要障碍是肽链的构象熵 当几个没有连接的肽链进行自助装时 熵势垒比较难以克服 通过共价交叉连接可以减少构象熵 自然界唯一用于交叉连接的方法是二硫键 蛋白设计时用DAB 在合成模板上肽的组装 在模板上组装合成蛋白的方法特点 使用人工合成的模板代替天然蛋白中的连接二级结构的单元模板 寡肽 可形成两个反平行 折叠链 设计一个Pro Gly的转折 在链的两端设计一个二硫键 形成一个环状结构 线性多肽折叠为球状结构 不用模板或交叉连接而通过线性多肽折叠成球形的确定的三维结构是蛋白质设计追求的目标之一主要障碍 构象熵实例 螺旋根据 螺旋的两亲性 形成的 螺旋显著稳定性是因为形成明显的疏水核 还有Glu和Lys形成的盐桥 螺旋偶极的电荷中和 增加了在螺旋 转折连接处的柔性 基于组合库的全新蛋白质设计 核心问题 埋藏疏水部分常用方法 二元模式理论基础 极性 P 和非极性 N 氨基酸的特性含义 一方面要有利于形成二级结构 另一方面又要埋藏疏水残基应用 二级结构两亲片断的构建 P N P N P N P N P P N N P P N P N P P P N N P 非极性残基由DNA密码子NTN编码N 任何碱基极性残基由DNA密码子VAN编码V C A G的混合 二 蛋白质功能的全新设计 蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的结构又具有有趣和有用的功能 功能设计主要涉及键合及催化为达到这些目的可以采用两条不同的途径 反向实现蛋白质与工程底物的契合 改变功能 从头设计功能蛋白质 蛋白质的功能设计 通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能 键合及催化的从头设计 在全新蛋白质中引入结合位点 催化活性蛋白质的设计 膜蛋白及离子通道的设计 新材料的设计 第三节计算蛋白质设计 蛋白质设计是一个理论与实验之间的循环 这个循环已经在蛋白质的合理设计中得到了许多重要进展计算蛋白质设计包括能量表达 能量优化 侧链构象的离散化 残基分类 内核 表面 边界 功能位点设计 专一性 稳定性及序列空间的稳健性预测等方面内容

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