时间：December 2, 2021

单位：俄克拉荷马州医学研究基金会

链接：https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2021.11.003

期刊：The American Journal of Human Genetics (AJHG, IF=11)

题目：OGDHL基因的双等位基因变异导致一种神经发育谱系疾病，表现为癫痫、听力损失、视力障碍和共济失调

前 言

克雷布斯 (Krebs)循环 ，也称三羧酸 (TCA)循环，在所有后生动物的线粒体新陈代谢中起着至关重要的作用。Krebs循环中编码酶或酶复合体亚单位的基因的致病变异会导致隐性神经代谢性疾病。这些疾病及其病因的基因包括：Leigh综合征或Leigh样疾病 (DLD [MIM: 238331]，SUCLG1 [MIM: 611224]，SUCLA2 [MIM: 603921]， SDHA [MIM: 600857]， FH [MIM: 136850])，婴儿小脑视网膜变性 (ACO2 [MIM: 100850])，婴儿白质脑病 (SDHAF1 [MIM: 612848])，以及一种特定的发育和癫痫性脑病亚型 (MDH2 [MIM: 154100])。

以上疾病的特征为发育迟缓和神经系统上的表现，包括癫痫发作、共济失调、视神经萎缩和脑病，发病通常发生在婴儿期。

2-酮戊二酸脱氢酶样蛋白 (2-oxoglutarate dehydrogenase-like, OGDHL)是Krebs循环中的限速酶，在线粒体代谢中起着关键作用。OGDHL的表达主要在人类的大脑，提示OGDHL参与了脑的发育和功能。

本研究报告了来自8个无关家系的9名携带OGDHL双等位基因变异的个体，他们的神经发育表型包括：癫痫、听力损失、视力障碍、步态共济失调、小头畸形和胼胝体发育不良。从携带双等位基因OGDHL变异的个体中鉴定出的9个单核苷酸变异 (SNV)都是功能缺失 (Loss-of-function, LOF)等位基因，表明OGDHL功能丧失是人类神经发育疾病的基础。

结 果

临床表现

作者通过全外显子组测序 (WES)鉴定了来自8个家系的9个个体携带OGDHL基因的双等位变异。所有这些家系都有OGDHL纯合子变异 (家系1、5、7为错义，家系6出现移码，家系8为提前终止)，其中有3个个体表现出复合杂合变异 (家系2、3、4)，见下图Figure 1A。表Table 1中总结了受影响个体的临床特征。

Figure 1A. 8个家系，均为隐性遗传

↓Table 1. Individual (family) 临床特征 com.het (复合杂合)

患者发病时间在2个月到8岁之间，中位发病时间为1.9岁。

9个人中有8个出现了轻度到严重的发育迟缓。

有4人 (个体3，5，6、8)进食困难，8人有过度的笑或哭。

6人 (1，3，5，6，8、9)表现出眼科损害，包括视力障碍，眼球震颤和视神经萎缩。

4人 (1、2、3、9)中发现严重的双侧感音神经性听力损失。

5人 (3、4、5、6、7、9)有畸形特征，主要包括高度弓形的腭部、双侧上睑下垂和眼睛向下倾斜等明显的头面部特征。

7人(1、2、3、5、6、8、9)神经学检查显示出现步态共济失调、痉挛、神经病变和低眼压。

5人(1、4、5、6、9)至少有一次癫痫发作，表现形式多种多样 (缺席、强直、强直阵挛、肌阵挛无张力、无张力、局灶性运动性发作和婴儿痉挛)。

1人 (4)表现出严重的迟钝状态。

5、6和9的脑电图是不同的，普遍的多焦减慢和多焦锐性放电混合在一起。这可能提示严重的双侧脑功能障碍，具有多灶性和全面性癫痫样电位。

4人 (3、6、7和9)接受了脑MRI检查。在神经影像上观察到不同的异常频谱。个体6的MRI扫描显示胼胝体细长，存在弗兰克基底神经节 (Frank basal ganglia)空洞损伤和囊性白质软化。个体6和个体3的小脑干核团 (Small brain stem nuclei)均有信号异常。个体7的MRI扫描显示一个低级别肿瘤，个体9的MRI扫描显示有轻微的皮质功能障碍。

受影响个体的MRI与面部特征

遗传学发现

利用WES在先证者中发现了OGDHL的11个新双等位变异。已鉴定的5个变异是纯合的：3个错义突变(个体1和2的c.2554C>G(p.Pro852Ala)；个体6中的c.730C>T(p.Arg244Trp)；个体8中的c.895A>G(p.Arg299Gly)；个体7中的一个移码变异c.1658delG (p.Cys553Leufs*16)。个体9中的一个终止变异c.1318C>T (p.Arg440Ter)。家系2、3和4中的3个个体携带复合杂合SNV：个体3中的c.2018G>A(p.Arg673Gln)/c.1464T>C(p.Val488Val)，个体4中的c.2201T>C(p.Phe734Ser)/c.980C>T(p.Ala327Val)，以及个体5中的c.660G>C(p.Trp220Cys)/c.1472A>T (p.Asp491Val)。所有改变的残基在物种间进化上是保守的。

物种间多序列比对图

Phe734Ser杂合子变异此前已被认为与嗜酸性食管炎有关。其他变异之前还没有被报道为致病变异。在家族1、2、3和6 (Pro852Ala、Arg673Gln、Ala327Val和p.Cys553Leufs*16)中发现的变异在数据库中均缺失，如gnomAD、ESP、GME Variome和Iranome，以及英国伦敦大学学院皇后广场基因组(Queen Square Genomics, UCL)超过16,000个外显子数据。所有的突变的预测都有很高的CADD评分，平均CADD评分为31.2，因此最有可能是破坏性和有害的突变。

在计算机同源建模和结构分析中发现影响个体的错义突变

在蛋白结构模型中，每一种变异都会改变预测的蛋白质结构。该模型显示OGDHL形成一个同源二聚体，其中每个亚基与TPP (Thiamine pyrophosphate)辅因子结合，形成底物结合口袋。重要的是，该模型表明，两个突变体Phe734Ser和Arg299Gly的突变残基位于底物结合口袋中。Phe734的侧链是TPP的嘧啶环和噻唑环的部分结合位点，并有助于包括TPP的嘧啶环在内的芳香侧链传递。Phe734 (F734S)的丝氨酸替代会破坏这种相互作用。Arg299与结合的TPP的β-phosphate形成相互作用。这种相互作用对TPP结合至关重要，因此预计Arg299 (R299G)的甘氨酸取代会削弱这种相互作用。

作者检查了其他6个错义突变Pro852Ala、Arg673Gln、Asp491Val、Trp220Cys、Arg244Trp和Ala327Val。Pro852的侧链形成局部芳香脯氨酸相互作用。丙氨酸取代脯氨酸852 (Pro852Ala)会消除这种相互作用，对结构稳定性产生负面影响。Arg673与Glu644和Glu731的侧链形成相互作用，与Val665的主链羰基形成氢键。谷氨酰胺取代Arg673 (Arg673Gln)预计会破坏相互作用的稳定性，因为它的侧链较短，而且没有正电荷。Asp491的侧链与相邻β折叠的Asn430和His461侧链形成氢键，这有助于β折叠的稳定性。因此，天冬氨酸突变为缬氨酸 (Asp491Val)将使β折叠不稳定。Trp220与Trp480、Phe484一起形成芳香族簇。Trp220 (Trp220Cys)上的半胱氨酸突变会破坏这个芳香族簇的T形π-π堆积。Arg244Trp取代会导致柔性表面带电残基的丢失和增加刚性的大体积色氨酸残基，这除了会导致与相邻螺旋上的残基发生空间位阻作用外，还可能降低熵和蛋白的溶解度。Ala327暴露在表面，丙氨酸对缬氨酸突变可能会降低蛋白质的溶解度，使更多的疏水侧链暴露在表面。作者还检查了之前发现的致病变异Ser778Leu，它是人类严重神经发育缺陷的基础。发现Ser778Leu会干扰周围的局部结构，因为没有足够的空间容纳庞大的亮氨酸侧链，这将影响Pro980和Thr982，破坏二聚体界面的稳定。结构分析表明，从携带双等位基因OGDHL变异个体中鉴定出的错义突变可能损害OGDHL的结构和功能。

错义突变对蛋白质水平的影响

为了确定鉴定出的一系列错义突变对体内蛋白质水平的影响，本研究培育了携带dOgdh cDNA的转基因果蝇，dOgdh是人类OGDHL的直系同源物，在上游激活序列 (Upstream activating sequence, UAS)的控制下携带人类错义突变的同源突变。

OGDHL的错义突变对果蝇神经元中蛋白水平的影响

使用pan-neuronal Gal4 (elavC155-Gal4)程序，表达了每个突变型转基因，野生型dOgdh (UAS-dOgdhWT)，以及致病性S778L变异体 (UAS-dOgdhS793L)的果蝇突变。免疫印迹显示，果蝇Arg316Gly (人Arg299Gly)和果蝇Phe749Ser (人Phe734Ser)，导致蛋白质水平大幅下降。此外，还发现果蝇Arg688Gln (人Arg673Gln)的蛋白水平明显低于野生型对照，果蝇Arg261Trp (人Arg244Trp)引起的蛋白水平下降幅度较小。相反，果蝇Ser793Leu (人Ser778Leu)导致蛋白质水平显著升高。这表明Ser793Leu可能导致蛋白质质量控制系统无法降解的错误折叠蛋白质聚集体。果蝇Pro867Ala (人Pro852Ala)、果蝇Ala343Val (人Ala327Val)、果蝇Trp237Cys (人Trp220Cys)和果蝇 Asp507Val (人Asp491Val)的蛋白水平与野生型对照 (DOgdh WT)的蛋白水平没有显著差异。因此，这些结果提示Arg673Gln、Arg299Gly和Phe734Ser可能导致OGDHL功能丧失。

dOgdh-null突变体果蝇OGDHL变异体的体内功能研究

作者试图确定OGDHL中错义突变的功能效应。为此，在之前的工作中，通过使用重组介导的盒式交换将T2A-Gal4 盒插入dOgdh的内含子中，从而为dOgdh创建了功能丧失突变体。dOgdh突变等位基因 (dOgdh-T2AGal4)在dOgdh的内源顺式调控元件控制下表达GAL4基因，GAL4蛋白反过来激活UAS下游基因的表达。

dOgdh-T2A-Gal4等位基因以及Gal4/UAS系统

先前的研究表明，dOgdh (dOgdh-T2A-Gal4纯合)的缺失导致了致死性，野生型dOgdh (dOgdhWT)的表达而不是携带与人OGDHL(Ser778Leu)(dOgdhS793L)同源突变的dOgdh的表达挽救了dOgdh的致死性。这些结果表明，dOgdh-T2A-Gal4突变体是解释人类OGDHL疾病候选变异的合适模型。利用dOgdh-T2A-Gal4突变体和携带UAS-dOgdh cDNA的转基因果蝇进行了致死性挽救试验。以携带UAS-dOgdhWT和UAS-dOgdhS793L的果蝇为对照。作者发现，8个新的错义突变中没有一个的表达挽救了dOgdh缺失造成的致命性。因此，结果表明所有8个错义变体都是功能丧失等位基因。

用dOgdh-T2A-Gal4等位基因测试OGDHL的8个新变异的功能

OGDHL变异体在神经元中的功能研究

在人类中，OGDHL主要在大脑中表达，而OGDH则无处不在地表达。果蝇同源基因dOgdh (人类OGDHL和OGDH)广泛表达于神经和肌肉系统等组织中。因此，来自dOgdh-null突变体(dOgdh-T2A-Gal4)的研究不能确定这些突变体对神经系统的功能影响。为了确定所识别的变异体在神经系统中的特异性影响，为此开发了一种新的CRISPR-Cas9介导的组织特异性基因敲除(ko)的方法和cDNA挽救系统。

目前在果蝇领域的CRISPR-Cas9方法允许组织特异性，但大多数引导RNA (gRNAs)针对外显子，从而同时针对基因组位点和cDNA转基因。因此，目前的系统阻止通过cDNA转基因表达挽救敲除表型。本研究克服了这一技术障碍，开发了一种策略，通过使用与目标基因的外显子-内含子连接互补的gRNA，选择性地针对基因组位点，而不是UAS转基因。图中说明了如何应用这种新方法来研究OGDHL变异对神经系统的功能影响。

CRISPR-Cas9介导的神经元特异性dOgdh基因敲除和cDNA挽救系统

为了确定神经元敲除dOgdh的影响，培育出携带dOgdh (gRNAdOgdh)gRNA的转基因果蝇，由U6：3启动子广泛表达，并且UAS-Cas9.P2由pan-neuronal Gal4 (elavC155-Gal4)表达。神经元敲除dOgdh(elavC155-Gal4; U6:3-gRNAdOgdh/UAS-empty; UAS-Cas9.P2)导致致死，这完全被野生型 dOgdh cDNA 的表达所拯救。

通过对果蝇头部进行Sanger测序，证明了gRNAdOgdh和Cas9.P2。在UAS转基因中有效地靶向dOgdh的基因组位点，而不是dOgdh cDNA。

一代测序验证

与dOgdh-T2A-Gal4分析不同，CRISPR-Cas9介导的神经元敲除结合cDNA拯救系统对8个错义突变体显示了不同的等位基因强度。首次发现dOgdhR688Q、dOgdhF749S和dOgdhR316G三个错义突变体不能挽救dOgdh神经元敲除dOgdh引起的发育致死性。结果表明，这三个突变均为功能严重丧失的等位基因

这一结果与3D同源模型一致，该模型预测了残基在TPP结合中的重要作用(人Phe734Ser和Arg299Gly)，以及蛋白质水平的降低 (DM Arg688Gln、DM Phe749Ser和DM Arg316Gly)。相反，其他五个错义突变，dOgdhP867A, dOgdhA343V, dOgdhW237C, dOgdhD507V和dOgdhR261W，挽救了致命性。

作者通过免疫印迹实验证实了带有这五种错义突变的dOgdh蛋白在大脑中表达。发现携带dOgdhR261W的果蝇在第5天和第10天都表现出对机械应激的缺陷，而其他四个变异体dOgdhP867A、dOgdhA343V、dOgdhW237C或dOgdhD507V的果蝇在第5天表现出与野生型相似的恢复，但在第10天表现出恢复的延迟。

CRISPR-Cas9-mediated neuronal dOgdh knockout model shows various strength of OGDHL missense variant

因此，这些数据表明Arg261Trp与其他四个变异体 (Pro867Ala、Ala343Val、Trp237Cys和Asp507Val)相比具有更多的基因功能缺陷。结果表明，三个错义突变 (Arg688Gln、Phe749Ser和Arg316Gly)是严重的功能丧失等位基因，另外五个错义突变 (Pro867Ala、Ala343Val、Trp237Cys、Asp507Val和Arg261Trp)是亚型等位基因。

错义突变p.Val488Val的剪接效应

个体3携带复合杂合突变，由于同义的c.1464T>C (p.Val488Val)变异被预测会导致剪接位点的改变，评估了它对OGDHL转录本的影响。从个体3的成纤维细胞中提取RNA，逆转录成cDNA。尽管OGDHL在该标本中的表达量很低，但能够扩增出OGDHL转录本的很大一部分 (外显子5到19)，在对照中显示出单条带，在个体3中显示出微弱的双带。通过进行NGS，除了全长转录本之外，还检测到了与第11外显子跳过相关的替代转录本，即 Δexon 11。有趣的是，Δexon 11转录本在对照组中也存在，但百分比很低(约15%)。相反，在个体3中，Δexon 11的转录本约为50%，这表明Δexon 11转录本的过度表达是由于同义变体的存在。

NGS analysis of OGDHL transcript for individual 3

缺乏OGDHL的神经元线粒体代谢缺陷

为了确定神经元中dOgdh的缺失是否影响Krebs循环代谢，利用LC/MS对dOgdh 敲除果蝇幼虫脑和对照脑进行了代谢物谱分析。发现dOgdh的底物α-KG在dOgdh 敲除的大脑中显著升高。相反，与对照组相比，dOgdh突变大脑中Krebs循环的其他代谢物(包括柠檬酸、苹果酸和富马酸)的水平下降，表明dOgdh是大脑中正常Krebs循环代谢所必需的。

作者预计大脑中dOgdh的丢失会导致dOgdh反应产物琥珀酸水平的降低。然而，dogdh突变体大脑中的琥珀酸水平与对照组相当，这表明琥珀酸可以通过回补反应补充氨基酸，包括蛋氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苏氨酸。有趣的是，虽然苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的水平在突变体和对照中相似，但在dOgdh 敲除脑中蛋氨酸显著降低。这表明蛋氨酸分解代谢很可能会补充琥珀酸作为一种补偿机制。

鉴于线粒体呼吸所需的Krebs循环代谢，假设OGDHL在人类神经元中的丢失导致线粒体呼吸的缺陷。为了验证这一点，作者通过使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑，建立了具有OGDHL突变的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y。慢病毒介导的两个针对OGDHL外显子2的gRNA的转导导致相当一部分细胞携带缺失突变(gRNA1导致95%的缺失；gRNA2导致98%的缺失)。试验证实，携带OGDHL突变的SH-SY5Y细胞显示OGDHL蛋白水平下降，而不是OGDH蛋白水平下降。测量了耗氧量后，发现敲除OGDHL细胞的耗氧率(OCRs)和ATP产生明显低于对照细胞，这表明OGDHL是人类神经元正常线粒体呼吸和能量产生所必需的。因此，OGDHL在神经元线粒体代谢中的关键作用表明，携带OGDHL双等位基因变异是导致Krebs循环和线粒体呼吸的缺陷的病因之一。

Neurons lacking functional OGDHL leads to defects in mitochondrial metabolism

结 论

总而言之，本研究在八个家系中识别了9个人，其中发现OGDHL基因具有双等位变异的无关家族表现出不同的神经表型，包括发育性和癫痫性脑病，视力受损、听力丧失、智力残疾和胼胝体发育不良。在功能研究中，一种新的CRISPR-Cas9介导的基因敲除和cDNA挽救系统显示8个OGDHL错义突变是功能缺失型。进一步分析来自成纤维细胞的转录组分析表明家族2中的同义突变破坏了OGDHL的剪接。综上所述，确定了OGDHL是一种致病基因，其损伤导致明显的、主要为神经表型的孟德尔疾病。

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