皮肤样本微生物的检测介绍

从公元前400年，希波克拉底第一次描述念珠菌感染起，研究者们一直在探究与人类共生的微生物对人体健康及疾病的影响。皮肤作为人体最大的器官拥有约1.8m２的表面积，其主要功能是作为物理屏障，保护机体免受外来生物或有毒物质的侵害。同时，皮肤也是人体与外界环境接触的部位，因此常驻有各类微生物，包括细菌、真菌、病毒等。如果将皮肤看作一个生态系统，那么它就是由各类微生物和皮肤表面的组织、细胞及各种分泌物等共同组成的整体。微生物群落与皮肤表面组织之间维持着动态的平衡，这种平衡一旦被打破，就可能会引起皮肤病或感染。

早期的皮肤微生物研究主要采用传统的分离培养方法，来识别和描述微生物群落的组成和多样性。传统方法的局限性使研究者难以正确全面地阐明皮肤微生物的群落结构和多样性特点。高通量测序从根本上改变了人们对微生物群落的认识，使人们得以系统地分析和认识皮肤微生物的群落及其功能。基于16S rRNA /ITS基因，优化实验方法，增加对痕量微生物的研究，利用二代测序技术（Roche 454、Illimina MiSeq/novaseq、Ion Torrent PGM）来分析皮肤微生物的多样性，为进一步理解皮肤微生物群落的结构特点及其与皮肤组织和环境的相互关系提供了研究渠道。

在分析微生物的群落组成时，必须要考虑到外源性微生物DNA污染的问题，在低生物量的样本中这个问题尤为重要。皮肤样本中的微生物量一般都很低，因此在设计实验的过程中，每一个步骤中都最好加入不含任何微生物DNA的空白样品作为对照，避免外源性污染导致分析结果出现偏差。以皮肤拭子样本为例，在采样时可以准备空白拭子，在空气中静置片刻后放入采样管中，作为采样的空白对照样品（因为痕量微生物的变化比较大，这里建议多做几个空白对照样本），在抽提基因组时，空白对照样本和实验样本一起进行，得到采集耗材和抽提试剂的空白对照DNA。PCR扩增时，采集耗材和抽提试剂的空白对照DNA也一起进行实验，同时也要设置只有PCR扩增试剂的空白对照。若实验样本的抽提和PCR扩增结果都呈阳性，而所有空白对照的结果都为阴性（电泳检测没有明显的PCR扩增条带），则可以证明样本中基本不存在外源性微生物DNA的污染，可以对样本正常地进行后续的测序和分析。具体案例可参见下文的案例一。

案例一：Probst AJ, Auerbach AK, Moissl-Eichinger C. Archaea on human skin. PLoS ONE, 2013, Volume 8, Issue 6.

文章主要研究人表皮上古细菌的分布情况，并探究这些古细菌与人体的共生关系。使用无菌拭子在志愿者的躯干前侧进行取样，取样后迅速将拭子冻存，用于后续的DNA抽提、qPCR定量以及16S rRNA和amoA的PCR扩增和测序。在采样、DNA抽提、qPCR和PCR扩增的过程中，每一个步骤都设置了至少一个空白对照，与实验样本同时进行处理。所有空白对照样本的qPCR和PCR结果都为阴性。

但是对于一些生物量极低的样本，外源性微生物的污染很容易造成实验样本出现假阳性的结果，因此这类样本的处理和PCR过程异常困难。在某些极端的情况下，一个样本的测序结果中有80%的序列都有可能是来自外源污染物的。针对此类情况，现在比较普遍的解决方案就是将空白对照样本和目标样本一起进行高通量测序，根据测序结果，从目标样本中移除那些可能来自外源微生物的序列。

现在已经有几种方法可以用于识别并排除样本中的外源性微生物序列，其中一种比较简单的方法就是将同时出现在目标样本和空白对照样本中的序列直接去除。此方法的具体操作可以参考下文的案例二。

案例二：Mira G, Anirudra P, Olli HL, et al. Short-term direct contact with soil and plant materials leads to an immediate increase in diversity of skin microbiota. MicrobologyOpen, 2019, Volume 8, Issue 3.

文章主要研究在接触了土壤和植物等自然物质后，人类皮肤上的细菌多样性发生的变化，希望以此深入研究免疫系统疾病的发病机制。在志愿者接触环境样本前后，分别用无菌拭子在其手背上进行采样，并进行基因组抽提和16S高通量测序，同时还做了无菌水的空白对照一起进行测序。分析高通量测序的结果，若拭子样本中的序列同时也出现在了空白对照样本中，则在最终的分析过程中需要将样本中的序列做等量删减。

另一种效果更好的方法就是利用分析软件来排除外源性微生物序列，常用的软件为Decontam。该软件通过分析微生物在样本中和空白对照中出现的频率和普遍性来排除外源性微生物序列，其主要判断依据为：来自外源性微生物的序列出现的频率与样本DNA的浓度呈负相关关系，且此类序列在空白对照样本中的普遍性会高于测试样本。使用Decontam进行数据分析的过程可参考案例三。

案例三：Lossius A, H, Sundnes O, Ingham A, et al. Shifts in the Skin Microbiota after UVB Treatment in Adult Atopic Dermatitis. Dermatology, 2022, Volume 238: 109-120.

为了能够对过敏性皮炎的病理学进行更深入地理解，研究者对过敏性皮炎患者使用了窄谱UVB进行治疗，于治疗的不同阶段在患者皮损和健康部位分别进行采样，并进行基因组抽提和16S V3-V4高通量测序。使用开源软件Decontam对测序结果进行分析，识别并排除了38个外源性微生物的ASV。

微基生物现在可采用Decontam对痕量皮肤微生物样本的测序结果进行分析。同时我们在以上几种方法的基础上另外开发出了一套全新的专门针对低生物量样本的测序方案，大大提高了此类样本测序的成功率和测序结果的准确性。

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