细胞外囊泡(extracellular vesicles)是由细胞释放的膜性小囊泡，存在于血浆、尿液、脑脊液等生物体液中。国际细胞外囊泡协会将它们分为外泌体(50-150 nm)、微囊泡(100-2000 nm)和细胞凋亡小体(1-4 μm)，其中，外泌体和微囊泡在细胞间交换其包含的蛋白质、脂质和核酸遗传物质^[1]，被认为是细胞间通信的一种方式。越来越多的学者认为细胞外囊泡有望成为疾病的循环生物标志物，被视为“液体活检”的重要检测指标^[2]。

图1 细胞外囊泡被分为外泌体(50-150 nm)、微囊泡(100-2000 nm)和细胞凋亡小体(1-4 μm)

近日，华大质谱研究团队通过研究细胞外囊泡(外泌体、微囊泡)和血浆，筛选出可以显著提升早产预测准确性的生物标志物，研究成果“Lipidomic Biomarkers of Extracellular Vesicles for the Prediction of Preterm Birth in the Early Second Trimester”发表在质谱领域权威期刊Journal of Proteome Research^[3]。

该研究首次利用脂质组学技术，从血浆、微囊泡和外泌体中分别发现了97、58和10个不同的脂质特征离子，全面阐明了早产孕妇和健康孕妇在孕早中期脂质组的差异。更重要的是，相较于传统临床上早产预测指标——孕妇宫颈长度测量，阳性预测值仅21%，特异性52%，本研究筛选出5种孕妇血浆外囊泡脂质分子对早产的预测值高达87%，特异性71.2%，因采血方便无创的特点，为早产的无创检测提供了候选生物标志物^[4]。

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研究设计思路

本研究采用组学经典研究路线，在发现阶段用非靶向脂质组学的方法分析了66例足月妊娠孕妇和27例早产孕妇，从血浆、微囊泡和外泌体3个层面全面阐述脂质组的差异。随后在验证阶段，选择42例足月妊娠孕妇和41例早产孕妇，采用拟靶向脂质组学的方法对上述候选脂质生物标志物进行验证。

图2 整体设计思路

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重要成果

1)早产孕妇和正常孕妇的血浆、微囊泡、外泌体脂质具有表达差异：

对血浆、微囊泡和外泌体中发现的97、58和10种脂质特征离子鉴定分析分别得到428、267和135个脂质分子。虽然在这三类样本类型中的脂质组成有明显差异(图3 b，c，d)，但是早产孕妇组别的溶血磷脂(Lysophospholipid，LP )含量在3种样本类型均高于足月妊娠组。这类脂质的积累会造成细胞膜损伤导致氧化应激的发生，而且作为炎症性脂质介质的重要前体和信号分子可能会导致慢性低水平炎症，这些临床表现都是影响孕妇早产的风险因素。

图3 早产孕妇和正常孕妇血浆、微囊泡、外泌体脂质的表达差异

2)相比血浆和外泌体，微囊泡脂质组对早产的预测能力更好：

通过接受者操作特性曲线(Receiver operating characteristic curve，ROC)分析，评估基于血浆、微囊泡和外泌体中的脂质，来区分早产孕妇和正常孕妇的能力。选择AUC(Area Under Curve)>0.8的脂质分子，在血浆样本筛选到1个候选标志物--氧化甘油磷脂类OKODiA-PI，微囊泡中筛选的5个候选标志物，PS (34:0), PS (O-42:0), PI (O-36:1), C24 (OH) sulfatide 和PE (O-33:0)，在外泌体中没有发现符合要求的标志物。二元逻辑斯蒂回归进一步分析了微囊泡中这5种脂质候选生物标志物相结合预测早产的能力：PS (34:0)、PS (O-42:0)、PI (O-36:1)、C24 (OH) sulfatide和 PE (O-33:0) 结合起来可以很好地区分正常孕妇和早产孕妇 (AUC=0.87)，灵敏度和特异性分别达到100%和71.2%(图4 b，c)。这表明相较于血浆和外泌体检测，微囊泡脂质组对早产的预测能力更好。

图4 发现集中早产孕妇脂质生物标志物的筛选

3)验证集微囊泡中候选脂质标志物的验证：

由于缺乏微囊泡中五种候选脂质生物标志物的标准品和相应的内标，采用拟靶向脂质组的手段对4种四种有碎片离子的早产候选生物标志物(PS (34:0), PI (O-36:1), C24 (OH) sulfatide, PE (O-33:0))进行验证。最终验证脂质标志物PS(34:0)在早产孕妇血浆微囊泡中下调，且能够较为准确地实现早产孕妇和正常孕妇的检测判别。

图5 验证集中脂质生物标志物的确定

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科技君点评

1)细胞外囊泡的分离是制约外泌体、微囊泡等研究的重要因素，本研究中华大质谱研究团队采用超速离心法高效地实现两种胞外囊泡的分离，以蛋白质印迹、透射电镜和纳米粒子跟踪分析方法对其进行了必要的表征。

2)脂质组学生物标志物验证，因脂质分子存在较多同分异构体、结构相似，且缺少商业化的标准品，不能实现候选脂质标志物准确验证，拟靶向脂质组学的技术有望成为解决在验证阶段脂质标准品缺少的新方法。

3)对于早产早期诊断研究，首次采用血浆、血浆外囊泡、血浆外泌体脂质组学的研究方法，更加全面的阐明早产孕妇与正常孕妇脂质组的差异，发现微囊泡中的脂质有助于早产的早期诊断，有助于了解早产潜在的发生机制。

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参考文献

[1] Van Niel, Guillaume, Gisela d'Angelo, and Graça Raposo. "Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles." Nature reviews Molecular cell biology 19.4 (2018): 213.

[2] Fujita, Yu, et al. "Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis." Trends in molecular medicine 21.9 (2015): 533-542.

[3] Zhao, Qianqian, et al. "Lipidomic biomarkers of extracellular vesicles for the prediction of preterm birth in the early second trimester." Journal of Proteome Research (2020).

[4] Al Habashneh, Rola, Yousef S. Khader, and Olfat Al Jabali. "Prediction of preterm and low birth weight delivery by maternal periodontal parameters: receiver operating characteristic (ROC) curve analysis." Maternal and child health journal 17.2 (2013): 299-306.

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