睡眠期间人类海马体中缓慢振荡、纺锤波和波纹的分层嵌套

在系统层面的巩固过程中，最初依赖于海马体的记忆表征被认为会迁移到新皮层以进行更永久的存储，睡眠在促进这种信息传递方面起着重要作用。巩固过程被假设依赖于表征非快速眼动(NREM)睡眠的三种基本神经元振荡之间的系统相互作用。在去极化和超极化慢振荡(SOs)的整体控制下，睡眠纺锤波可能聚集在海马体波纹中，精确地将局部信息传递到新皮质。我们利用人类癫痫患者在自然睡眠期间的直接颅内脑电图记录来测试海马中SOs、纺锤波和波纹在功能上是耦合的假设。通过交叉频率相位-振幅耦合分析，我们发现纺锤波受SOs（超极化慢振荡）的上态（up-state）调制。值得注意的是，纺锤波被发现在它们的波谷中聚集波纹，为海马体记忆痕迹的假设转移提供了微调的时间框架。本文发表在Nature Neuroscience杂志。

1. 介绍

新的经历是如何转化为持久的记忆痕迹的?根据记忆形成的两阶段模型，记忆表征最初依赖于海马体，海马体是内侧颞叶(MTL)记忆系统的关键区域之一。在“巩固”的过程中，这些表征被认为迁移到新皮层以进行更永久的存储。人们一致认为，在没有意识信息处理干扰的情况下，非快速眼动(NREM)睡眠有助于巩固海马依赖的记忆内容。然而，海马-新皮质交流背后的确切神经元机制仍不清楚。

神经元的信息传递需要一个精确的时间结构，而在睡眠期间(没有外部刺激的情况下)，这个结构必须由大脑自发活动本身提供。非快速眼动睡眠的特征是三个基本的神经元振荡，它们可能为这种信息传递提供了时间支架。首先，SOs(~0.75Hz)反映了大神经元群联合超极化(down-states)和去极化(up-states)交替阶段引起的细胞兴奋性的整体波动。去极化是指跨膜电位处于较原来的参照状态下的跨膜电位更正(膜电位的绝对值降低)的状态。超极化是指细胞膜的内部电位向负方向发展，外部电位向正方向发展，使膜内外电位差增大，极化状态加强。尽管存在局部SOs，它们通常包围了整个大脑皮层、海马体和丘脑，在那里它们触发了睡眠纺锤波的释放。请注意，1-4Hz的“慢波”有时与SOs相结合来表示慢波活动(SWA)，但我们主要关注的是~0.75Hz的SOs。第二，在网状丘脑和丘脑-皮质神经元之间产生纺锤波，纺锤波的振幅在12-16Hz之间变化，丘脑-皮质神经元也将纺锤波投射回新皮层和海马。因此，皮质丘脑SOs输入不仅导致纺锤波在时间上分组成SOs上态，而且它们在整个新皮质的空间同步，尽管局部纺锤波存在。最后，波纹是高频爆发，在啮齿动物的海马CA1亚区观察到~200Hz，但在人类海马记录中观察到~80-100Hz的较低频率，伴随局部记忆痕迹的重新激活。

根据之前提出的“主动巩固”框架，在记忆巩固过程中，信息传递依赖于这三个电生理现象的复杂相互作用：去极化的SO上态被认为有助于纺锤波的出现，反过来，纺锤波将海马体中的局部信息捆绑起来，并将它们传输到分布的新皮层区域进行长期存储。值得注意的是，这个模型显示，在海马体中，来自新皮层的SOs的上态与来自丘脑的纺锤波相一致，从而启动了海马体-新皮层的交流。通过直接的颅内记录，我们发现了支持这三个关键振荡在人类海马体中分层嵌套的证据，从而为人类非快速眼动睡眠期间的神经元信息传递提供了一种机械论的解释。

2. 方法

本研究使用iEEG记录了耐药癫痫患者的iEEG。手术前评估时，采用立体定向植入深度电极，沿海马纵轴经枕叶植入，或沿颞叶外侧植入。所有患者均给予抗惊厥药物治疗。

对于睡眠记录，本实验还使用额外的电极Cz、C3、C4和Oz。同时还采集了眼电活动和肌电活动。Cz和海马区连续的原始数据以20s为间隔进行睡眠分期，分为清醒期、第1期、第2期、第3期、第4期和快速眼动睡眠。根据标准，采用头皮电极和同时监测的EOG和EMG来识别睡眠阶段。在随后的分析中，第2、3和4阶段被合并标记为非快速眼动(NREM)睡眠。

考虑到睡眠纺锤波在假设的振荡耦合中的核心作用(由SOs调制，进而调制波纹)，根据NREM/WAKE(清醒)功率谱比值，选择纺锤波频率范围(12-16 Hz)中最大峰值的海马后区。如补充图1所示，这种相对睡眠相关的纺锤波的功率增加在海马后区最强。

补充图1 a.(上)一名样本参与者的术后MRI(左，描述沿海马纵轴植入深度电极)和术前MRI(右)。

(下)同一参与者所有10个电极触点的功率谱(NREM/WAKE)，显示海马后触点的纺锤波范围最大值(12-16Hz，虚线)，然后进行分组分析(红色箭头)。

b.分析所有参与者的海马接触区情况。每块面板显示一名参与者的术后(上)和术前(下)MRI矢状面和冠状面切片。

为了评估PAC的特异性和先验定义的振荡事件，即SO-纺锤波PAC(0.75Hz至12-16Hz)和纺锤波-波纹PAC(12-16Hz至80-100Hz)，我们分别对头皮EEG(Cz)和海马iEEG(HC)进行了以下分析。

1. 事件检测和提取。基于所建立的检测算法，独立识别每个参与者和通道的纺锤波事件和波纹事件。SOs检测如下。首先，对数据进行0.16-1.25Hz滤波，仅使用NREM睡眠2-4阶段的无伪影数据进行事件检测。其次，在滤波后的信号中确定所有的零交叉点(即下态之后是上态)，并确定SO候选事件持续时间，分别作为Cz的两个连续的从正到负的零交叉点和HC的两个连续的从负到正的零交叉点之间的时间。满足SO持续时间标准的事件(最小0.8，最大2s，0.5-1.25Hz)进入下一步。第三，确定其余候选SO的事件振幅。同时满足SO振幅标准的事件(≥75%的SO候选振幅，即最大振幅的25%事件)被认为是SOs（超极化慢振荡）。最后，从未滤波的原始信号中提取所有事件的无伪迹分段(−2.5到+2.5s)，时间锁定到滤波信号中的SO下态。

2. 纺锤波的检测方法如下。首先，数据滤波在12-16Hz之间，仅使用NREM睡眠2-4阶段的无伪影数据进行事件检测。其次，利用200ms的移动平均值计算滤波信号的均方根信号，并将均方根值的75%作为纺锤波幅值判据。第三，当信号超过该阈值0.5s但小于3s(持续时间标准)时，检测到纺锤波事件。

3. 波纹检测如下。首先，数据在80-100Hz之间进行滤波，仅使用NREM睡眠2-4阶段的无伪影数据进行事件检测。其次，使用20ms的移动平均值计算滤波信号的均方根信号，并将波纹幅度准则定义为均方根值的99%。第三，只要信号超过这个阈值至少38毫秒(包含3个周期，80赫兹)，就会检测到波纹事件。此外，我们要求至少有三个离散的峰或三个离散的波谷发生在原始信号段对应于阈值以上的RMS段。这是通过在应用包括两个相邻数据点的一次移动平均滤波器后，在各自的原始信号段中识别局部最大值或最小值来完成的。第四，从所有事件的未滤波原始信号中提取无伪迹信号分段(−1.5-+1.5s)，时间锁定到滤波信号的最大波纹峰值。

随后使用滑动汉宁窗（SO:步长为10ms；纺锤波和波纹：步长为5ms）进行时频分析。对提取的每个事件分段中的所有时间点，分别采用希尔伯特变换提取低频(调制)振荡事件的相位值和高频(调制)振荡功率波动的相位值。然后在每个事件的两个相位值时间序列之间计算同步指数(SI)。得到的SI是一个复数，它的角度代表同步的“首选相位”(SIp)，即在这个低频的相位上的高频的功率在时间上是最大的：

为了可视化不同事件类型(SOs、纺锤波和波纹)彼此之间的时间关系，我们绘制了PETHs（事件时间柱状图），其中“目标”事件类型的时间发生相对于“种子”事件类型的时间分布。

为了同时评估大量频率对的PAC，我们应用了一种方法。简单地说，对于给定的频率对，在两个频率上分别对原始脑电图信号进行滤波。较低频率范围为0.75-20Hz，较高频率范围为3-200Hz。然后利用希尔伯特变换提取低频相位和高频幅值的时间序列。低频相位被分成18个20°的箱（bins），对每个箱子计算高频的平均振幅，然后除以所有箱子的总和进行归一化。接下来，通过计算MI，判断振幅分布P与均匀分布U之间是否存在可测偏差。

3. 结果

图1a显示了一名样本参与者的术后磁共振图像(MRI，带深度电极)以及术前MRI(不带深度电极)(所有参与者的电极位置见补充图1)。参与者的夜间记录平均持续10.65小时(s.d=2.92小时)，其中平均8.42小时(s.d=2.00小时)处于睡眠阶段1-4或快速眼动睡眠。图1b显示了一个参与者的睡眠图。各阶段所花费的时间比例见补充表1。我们分析的NREM睡眠期包括第2、3和4阶段。

图1 植入和睡眠记录

(a)一名被试的术后MRI(上)和术前MRI(下)。十字线放置在电极上。

(b)对样本参与者在一个记录夜晚的不同睡眠阶段所花费的时间进行图解描述(睡眠图)。

补充表1 不同睡眠阶段所花费的时间占总睡眠时间的平均比例。睡眠效率指的是从睡眠开始到最后一次醒来在1-4阶段或快速眼动阶段所花费的时间。

为了评估SOs、纺锤波和波纹的功能耦合，我们采用了两种互补的分析方法，这两种方法都观察了较快振荡的振幅(功率)是否由较慢振荡的相位系统地调制。

首先，我们采用事件锁定分析方法，根据这些现象的先验定义频率范围，对假设的SOs嵌套、纺锤波和波纹嵌套进行了具体测试。我们根据建立的检测算法和对应的时频表征(TFRs)，在海马iEEG中选择性地识别SO、纺锤波和波纹事件。因此，在各自的事件锁定TFR中，随着时间的推移，SO-纺锤波PAC和纺锤波-波纹PAC将作为功率调制出现。

其次，使用跨频耦合图（comodulogram）分析，我们同时在更广泛的频率对范围内评估PAC，以测试SO-纺锤波-波纹耦合的选择性，并探索是否存在其他尚未纳入睡眠期间海马处理模型的交叉频率相互作用。

3.1 时间锁定分析

我们的自动事件检测算法在每个参与者的海马体中平均产生545个SOs(s.d.=236)、821个纺锤(s.d.=470)和166个波纹(s.d.=88)。补充表2还列出了每个参与者的事件密度(每分钟发生的次数)，平均为3.7(s.d.=0.8)，SOs为5.4(s.d.=2.2)，波纹为1.2(s.d.=0.7)。值得注意的是，我们探索了广泛的检测标准(产生不同数量的事件)，并发现无论应用的特定阈值是什么，结果都是显著稳健的。

补充表2 无伪影NREM数据段的长度(“数据分钟”)，事件总数和事件密度(n个事件/数据分钟)，在海马体中检测到的梭形波和波纹。

3.2 头皮电极(Cz)检测SOs和纺锤波。

在检测海马体事件之前，我们希望确保我们的SO和纺锤波检测算法的实现能够复制在头皮电极Cz上发现的结果。事实上，补充图2描绘了TFR时间锁定到SO下态(低谷)，显示了SO事件期间纺锤波功率的典型调制(12-16 Hz)。其中，纺锤波功率在SO下态时下降，在随后的由下到上的转换中增加，在SO上态时达到峰值，并在SO事件之后表现出持续的抑制。这种SO-纺锤波调制的优选相位在参与者的上态周围聚集显著（平均优选相位=328°）。相反，8-12Hz范围内的功率则表现出相反的模式，在SO由上至下的过渡期间增加。

补充图2 头皮脑电图(Cz) PAC事件锁定分析。左:SO-纺锤波PAC。

(a)参与者的未滤波脑电图平均值。

(b)纺锤波锁定TFR（时频表征）的平均值（与事件前基线相比的变化百分比）。

(c)与事件前基线相比有统计学意义的变化。右：纺锤波PAC。虽然(a)中的脑电图显示了睡眠纺锤波典型的起伏模式，但在纺锤波峰值锁定的TFR(b)中没有观察到可靠的波纹功率调制。

3.3 海马SOs组纺锤波

SO-纺锤波相互作用已经在头皮EEG中(见上文)以及猫的侵入性皮层和丘脑记录中得到了很好的证实，但它们是否也存在于人类的海马体中尚不清楚。未滤波的海马iEEG轨迹，时间锁定到检测到的海马SO事件的下态，如图2a所示。图2b描绘了相应的平均海马TFR，以相对于-2.5s到-1.5s的SO前间隔的功率变化表示。值得注意的是，纺锤波功率(12-16Hz)在SO上态时显著增加，即相对于最大SO下态。图2c显示了统计阈值后在SO上态中出现的一个显著的纺锤簇。在参与者中，最大功率增加发生在14.5Hz。事实上，这种SO-纺锤波调制的首选相位在参与者中显著地向SO上态聚集(平均首选相位=160°)。图2d显示了来自单个参与者的数据，以更好地说明SO上态对纺锤波功率的调制。还请注意，图2b提示随着纺锤波功率的增加，波纹功率也随之增加，我们将在下面进一步分析。

图2 海马SO-纺锤波PAC事件锁定分析

(a)参与者的平均未滤波iEEG轨迹，与SO下态的最大值对齐。

(b) SO下态锁定的TFR（时频表征）的平均值(与事件前基线相比的百分比变化)。

(c)统计上较事件前基线有显著变化的区域。插图，每个参与者的SO-纺锤波调制首选相位的单位圆，这说明了纺锤波功率向SO上态的首选聚类。

(d)抽样参与者的数据。右，平均SO和TFR，将−1.5 s放大到+1.5 s，以5-30Hz的频率来突出SO上态的纺锤波功率嵌套。左，所有检测到的SO事件中首选SO-纺锤波调制相位的归一化直方图，导致该参与者的平均首选相位为187°(红线)。

虽然Cz上的SOs显示出快速(12-16Hz)和缓慢(8-12Hz)纺锤波的上、下态，但海马体(HC)上的SOs只是快速纺锤波。为了量化SO-慢纺锤波调制的跨区域差异，我们将慢速纺锤波范围定义为8-12Hz，快速纺锤波范围(如前所述)定义为12-16Hz。在Cz波谷或HC峰附近，SO下态的时间窗口设置为−250ms到+250ms，SO上态的时间窗口相对于Cz波谷或HC峰从+250ms到+750ms。尽管在SO上态，Cz和HC的快速纺锤波功率依旧增加显著，在SO下态，慢速纺锤波功率的增加仅在Cz显著，而在HC不显著。重要区域(Cz，HC)×纺锤波(快或者慢)交互也反映了一个事实：Cz和HC在慢功率下态有显著区别，但没有出现在快功率上态。这一发现与之前将快速而非缓慢的纺锤波与海马活动联系起来的研究一致，并表明这两种纺锤波在睡眠依赖记忆巩固中发挥着不同的作用。

另外，检测到的SOs可以是串联事件(即真实的多事件振荡)，也可以是孤立事件。我们发现，24.3% (s.d. = 5.2)的海马SOs和33.5% (s.d. = 7.7)的Cz SOs在±1.3s(~0.75 Hz)内出现另一个SO下态，因此是真正的多事件振荡的一部分(补充图3和4)。

补充图3 事件相关时间直方图(PETH)。

(上)Cz(左)和HC(右)被时间锁定到SO下态的SO事件的PETH，突出显示了一个SO周期的多个峰值(多事件振荡)。

(下)纺锤波出现时间锁定到纺锤波中心的PETH，显示可识别的峰值在SO频率重复。

补充图4 海马脑电图显示多事件SOs和嵌套纺锤波。

上图:未经滤波的原始脑电图轨迹，通过我们的自动算法将数据段标识为SO(绿色)和纺锤(蓝色)。

下图:应用特定事件带通滤波器后的相同数据段(SO: 0.5-1.25 Hz，纺锤波:12 - 16Hz)。

3.4 海马波纹嵌套在纺锤波波谷中

两阶段巩固模型的第二个关键组成部分是海马波纹嵌套在纺锤波谷中，因此利用突触兴奋性的细粒度时间窗促进跨区域的相互作用。时间锁定到最大纺锤波波谷(图3a)，图3b描绘了相对于纺锤波前间隔−2.5 s至−1.5 s的海马平均TFR。波纹功率(80-100 Hz)在纺锤波中心附近的500毫秒内显著增加，在86.8Hz (s.d = 12.2)时，参与者的最大功率增加。值得注意的是，离散波纹功率爆发嵌套在单个纺锤波波谷中(图3c)。这种纺锤波调制的首选相位在参与者的波谷附近聚集显著(平均首选相位=167°)。图3d显示了来自单个参与者的数据，突出显示了波纹嵌套在单个纺锤波循环中的高时间精度。我们注意到伪PAC可以从非正弦信号中产生。然而，这种伪PAC往往会在宽频范围内产生影响，这与我们观察到的边界清晰的PAC不同(图3)，它与之前在人类海马体中观察到的生理波纹的频率范围精确匹配。

图3 海马纺锤波PAC的事件锁定分析

(a)经过滤波后的平均iEEG。

(b)纺锤波波谷锁定TFR的平均值(与事件前基线相比的百分比变化)。

(c)统计上较事件前基线有显著变化。插图，每个参与者的纺锤波-波纹调制首选相位的单位圆，这说明了在纺锤波波谷中波纹功率的首选相位。

(d)一名参与者的数据。右，平均纺锤波和TFR。左，所有检测到的纺锤波事件的首选主轴-波纹调制相位的标准化直方图。

3.5 波纹锁定分析

最后，我们研究了当海马脑电对离散波纹事件进行时间锁定时，是否也会出现海马纺锤波-波纹耦合。为此，我们确定了类似于SOs和纺锤波的波纹事件。首先，脑电图证实了未滤波的原始数据中检测到的事件的振荡性质(图4a)。其次，它揭示了在delta范围内的明显偏转上的叠加波纹，在3Hz处显示了一个频谱峰值。在人类和非人类灵长类动物的海马记录中都观察到了波纹与“delta波”的相同耦合。波纹锁定TFR(图4a)，我们首先确认了我们确定的波纹的频带范围的性质，这与之前关于人类波纹的报告再次一致。注意，最大波纹功率增加发生在86.2Hz。值得注意的是，事件周边的TFR（时频表征）也显示了在波纹中心周围500 ms内纺锤波功率(12-16 Hz)的显著增加(图4)。参与者的最大纺锤波功率增加出现在14.6Hz (s.d. = 3.3)，这与最大纺锤波调制的频率相对应(图2)。

在图4b中，我们展示了上述同一参与者的平均波纹锁定的原始EEG轨迹(图2d和3d)。需要注意的是，当带通滤波的EEG轨迹围绕参与者的纺锤波最大功率(14 Hz)时，纺锤波波谷中嵌套的波纹再次变得明显。为了进一步确认波纹在连续纺锤波波谷内的嵌套，我们推导了相对于给定波纹中心时间其他波纹出现的概率。这个波纹PETH揭示了峰值出现概率明显跟随14.5 Hz的振荡(图4c)。最后，虽然波纹功率倾向于在纺锤波最大值之前达到最大，但我们发现纺锤波开始可靠地先于波纹开始(而不是波纹触发主轴)。

图4 海马的波纹

(a)参与者未经滤波的平均iEEG，对齐到波纹峰值的最大值(时间0)。第一个插图强调了未滤波的原始脑电图中检测到的事件的振荡性质。第二幅插图显示了脑电图的频谱分析结果，显示了3Hz的频谱峰值。中间图，波纹峰值锁定TFR的平均值(与事件前基线的百分比变化)，突出波纹的带限性质。下图，放大到5-30Hz，显示统计阈值设定前(上)和统计阈值设定后(下)的总体平均TFR，以突出主轴功率的波纹锁定增加。

(b)参与者的数据。上图，波纹锁定的平均原始EEG(实线)与带通滤波线(13.5-14.5 Hz，虚线)叠加，以突出在纺锤波波谷中嵌套的波纹。下图，对应的波纹锁定TFR，突出参与者在波纹和纺锤波范围内的最大值。

3.6 事件偶然性

总之，我们的研究结果为SOs对纺锤波的调制以及海马波纹在单个纺锤波波谷中嵌套提供了令人信服的证据。最后，我们开始量化这三种事件类型的偶然性，即SOs、纺锤波和波纹的时间共现。首先，在上述应用的相同分析框架中，当将分析限制在紧接有SO下态的纺锤上时，我们观察到显著的纺锤-波纹耦合。此外，在单个SO事件下态之后的0.2-1 s计算，波纹振幅(80-100 Hz)被12 - 16 Hz振荡相位显著调制。这些结果以真正的分层方式为SO-纺锤波波纹耦合提供了关键证据。

其次，基于我们的事件检测算法，发现21%的SOs触发纺锤波，使纺锤波中心位于最大SO下态后0.2到1秒之间。在这些纺锤波中，6%的纺锤波中心周围也有±0.5 s的波纹。但请注意，这些分析的结果在很大程度上取决于SOs、纺锤波和波纹的事件检测标准，以及用于定义时间共现的时间间隔。在另一项分析中，我们确定了SWS(慢波活动)期间检测到的所有波纹中有多少比例同时伴有纺锤波和SOs，揭示了24%的波纹与纺锤波和SOs同时发生。考虑到这些结果依赖于特定的阈值设置，我们需要确保我们获得的数值确实反映了三种事件类型的共同出现。为此，我们设计了一个替代数据分析，其中我们考虑了每个参与者检测到的SOs、纺锤波和波纹的数量。在SOs、纺锤波和波纹之间没有系统相互作用的零假设下，这些事件将随机分布在可用的样本中，运行1000次构造代理分布，在纺锤波中心出现SO以及在±0.5s内出现波纹的纺锤波的总体平均百分比为2%，且没有一次代理迭代达到经验值6%。以至于观察到的SO-纺锤-波纹聚类的百分比明显超过了概率。也就是说，对于没有立即出现SO下态的纺锤波，也观察到了显著的纺锤波-波纹耦合，未来研究这两种类型的纺锤波-波纹耦合对记忆巩固过程的贡献是否不同将是重要的。

3.7 跨区域PAC

为了测试SOs、纺锤波和波纹是否确实有助于睡眠时海马-新皮层的信息传递，我们分别量化了海马纺锤波和波纹与皮层SOs和波纹的耦合。为此，我们使用头皮电极Cz(代替其他皮层部位的颅内电极)，上述分析显示了清晰可检测的SOs和纺锤波(补充图2)。事实上，我们发现了Cz SOs (SOCz)与海马纺锤波(spindleHC)耦合和Cz纺锤波(spindleCz)与海马波纹(rippleHC)耦合的证据。对于SOCz-spindleHC耦合，在Cz SO上态时，海马纺锤波功率增加了20.5% (s.d. = 29.5)。同样，对于spindleCz-rippleHC耦合，Cz纺锤波中心附近的海马波纹功率从−250 ms到+250 ms增加了4.8%(s.d = 4.9)。

我们推断，在机制上，这种跨区域PAC很可能是通过在新皮层和海马体中同时发生的SOs和纺锤波的同步效应来实现的。推导出SOs和纺锤波在Cz和HC的共现概率(补充图8)，我们发现在±0.5s内，SOCz中19.1% (s.d. = 3.3)伴有SOHC，spindleCz中33.5% (s.d. = 8.5)伴有spindleHC。

补充图8 Cz和海马之间的跨区域CFC。事件周围时间直方图(PETH)描述了时间锁定到Cz的海马SOs (a)和时间锁定到Cz的海马纺锤波(b)的发生概率。

正如预期的那样，与未与SOHC共发生的SOCz相比，与SOHC共发生19.1%的SOCz的SOCz- spindleHc耦合显著更大。同样，与未与spindleHC共发生的spindleCz相比，与spindleHC共发生的spindleCz的33.5%的spindleCz的spindleCz- rippleHc耦合显著更大。

3.8 共线图分析

在通过预先定义的振荡事件(SOs、纺锤波和波纹)直接测试假设的PAC后，我们开始在更详尽的频率范围内探索海马PAC。在更宽的频率范围内发现PAC是前面介绍的PAC共线图方法。从概念上讲，临界调制指数(MI)是一种PAC测度，类似于用于事件锁定分析的PAC测度，因为它反映了调制(较高)频率的振幅随调制(较低)频率的相位变化的程度。首先，为了揭示非快速眼动睡眠特有的PAC，我们确定了非快速眼动的MI大于WAKE的频率对。其次，为了确保在NREM期间产生的影响不会因较大的振幅而产生偏差，我们导出了替代数据，其中使用了与真实PAC分析相同的数据，并将它们与原始NREM数据进行比较。

这个过程产生了四个簇(图5)。簇1复制了事件锁定分析中观察到的SO-spindle PAC，其最大值出现在调节14Hz活动振幅的0.75Hz振荡阶段。簇2通过在delta范围内的振荡来复制对波纹功率的调制，在3.25 Hz的振荡调制85 Hz活动的振幅时显示出其最大值。簇3复制了事件锁定分析中观察到的纺锤波PAC，其最大值在12.75Hz的振荡相位调制85Hz活动的振幅。注意，在簇2和簇3之间，80-100Hz振幅调制的首选相位存在显著差异，这表明波纹嵌套在纺锤波波谷中，但出现在delta振荡的峰值。最后，出现了一个额外的簇(簇4)，最大调制发生在10.25 Hz振荡调制22Hz的相位(慢纺锤波-beta PAC)。

图5 非快速眼动睡眠中的海马体PAC

这些结果不仅证实了我们基于事件的分析的主要结果，而且还强调了海马PAC对SO-纺锤波和纺锤波-波纹相互作用的相对选择性。慢纺锤波PAC，虽然不是当前系统整合的组成部分，但最近在睡眠头皮脑电图记录中被报道。

4. 讨论

虽然NREM睡眠对记忆巩固的作用早已被认识，但海马-新皮质对话假说的精确机制仍不清楚。现存的模型，首先是主动巩固框架，认为记忆巩固依赖于三种NREM睡眠基本特征—SOs、纺锤波和波纹的复杂相互作用。特别是，在新皮质SOs的影响下，丘脑皮层纺锤波被认为是在海马和新皮质之间服务于时间微调信息传递的海马波纹的群体。我们使用直接的电生理记录来测试一个默认的假设，即SOs、纺锤波和波纹在人类海马体中一致且系统地相互作用。

我们的研究结果与这一猜想达成了令人信服的一致，结果表明，记录在海马体中的睡眠纺锤波是由SOs协调的，而纺锤波反过来又在波谷中调制海马波纹。这种模式是通过两种互补分析观察到的。利用事件锁定分析，我们在已建立的检测算法的基础上识别SO和纺锤体事件，并使用事件中心来对齐更快的神经元振荡的TFR。该分析揭示了在海马SO波谷周围的纺锤波功率(12 - 16Hz)的强烈增加(图2)，也就是说，从海马向下到向上态的转变开始，类似于通常在头皮记录中观察到的SO-纺锤波调制(补充图2)。当依次将TFR与纺锤波事件中心对齐时(图3)，嵌套在纺锤波波谷中的波纹爆发的出现变得明显。最后，在我们的数据中识别单个波纹事件时，出现了相同的纺锤波耦合。锁波TFR不仅显示了纺锤波功率的强劲增长(图4a)，而且连续的波纹出现显示了恰好跟随纺锤波振荡的周期性(图4c)。

我们的第二个分析采用了一个共线图程序来评估，在一个步骤中，一个穷尽范围的频率对的相位-振幅耦合。这一分析有力地证实了事件锁定分析的结果(图5)。需要注意的是，两种分析都出现了相同的相位-振幅关系，即纺锤波功率向SO波谷方向增大，波纹在纺锤波波谷内嵌套。值得一提的是，虽然我们排除了乳突参考电极的假效应(补充图10)，我们的宏观电极记录仍然不知道记录信号下的精确神经发生器。

补充图10 对同一深度电极上最前面(11个参与者)或最外侧(1个参与者)接触的海马PAC进行事件锁定分析。

(a)样本参与者中用于重参考的位置(红线)。

(b)参与者未滤波的平均脑电图;

(c)事件锁定TFR平均值，锁定到SO峰值(左)和纺锤波波谷(右)。

尽管之前在动物和人类中进行的研究已经为SO-纺锤波耦合、SO-波纹耦合或纺锤波-波纹耦合在大脑不同区域或跨区域提供了证据，但据我们所知，第一个证据表明，这三种振荡确实在海马体中重合并有系统地相互作用，这是假定它们在促进海马体巩固过程中发挥作用的关键前提。例如，在许多啮齿类动物的记录中，海马波纹与新皮质SWA(慢波活动)或纺锤波有关，但与海马本身记录的SWA或纺锤波无关。之前的一项研究确实在啮齿动物的海马体中发现了SOs，但没有将它们与海马体或其他地方出现的纺锤波或波纹联系起来。最近一项对非人灵长类动物的研究报告称，SOs与海马体高频活动之间存在相位振幅耦合。然而，由于方法上的原因，高频范围被限制在30-80Hz，在该研究中没有调查纺锤波。最后，另一项研究报道了大鼠海马纺锤波振荡相位对海马高频活动的调节。然而，这些分析主要基于清醒和快速眼动状态，而不是快速眼动状态，且慢波(SOs)的中介作用仍未得到验证。在人类中，最近的一项iEEG研究表明，在海马SWA的特定阶段，海马波纹优先出现，但与纺锤波的关系尚未探索。在一项聚焦于纺锤波的后续分析中，作者能够证明生理纺锤波确实发生在人类的海马体中(正如我们观察到的;图3a)，但这些海马纺锤波与SOs或波纹的关系没有被检查。最后，最近在健康参与者中进行的一项脑电图-脑磁图(MEG)研究发现，头皮上记录的纺锤波聚集在40-100Hz的振荡，但神经发生器的位置仍然未知。

在两种分析中出现的另一种海马PAC关系是delta频段(最大频率在~3 Hz)振荡对波纹功率的显著调制。研究人员观察到，人类在学习后的午睡中记录的波纹有delta范围调制，最近记录的非人类灵长类动物的波纹也有delta范围调制。这种现象是反映了由经典delta波(非快速眼动睡眠的特征，但与SOs不同)调制的波纹，它是否参与了假设的海马-新皮层对话，仍有待确定。值得一提的是，我们报告的波纹频率范围(80-100 Hz)明显低于通常在啮齿类动物中观察到的范围(高达200 Hz)。然而，80-100Hz正是观察到的人类波动最大的地方，加上最近的数据显示，非人灵长类动物的波动在80-140Hz之间，符合随着不同物种的大脑尺寸增加，功能同源振荡的频率越来越低的概念。

尽管展示人类海马体中SOs、纺锤波和波纹的功能耦合很重要，但我们的数据也支持记忆巩固的两阶段模型中固有的跨区域耦合的概念。特别地，我们发现Cz记录到的时间锁定SOs的海马纺锤波功率增加，以及Cz记录到的时间锁定纺锤波功率增加。此外，我们能够表明，这种跨区域PAC是由SOs和纺锤波在Cz和海马体的时间共现驱动的，为假定的睡眠期间海马-新皮质信息传递提供了进一步的支持。

一个紧迫的问题是，观察到的PAC效应是否与情景记忆直接相关。研究发现，在完成海马体依赖的学习任务后，非快速眼动睡眠期间SO振幅会增加，而非快速眼动睡眠期间外部对SOs的增强会促进后续的记忆检索。同样地，人们发现学习后纺锤波密度会增加，并预测以后的记忆表现。最近的脑电图-功能磁共振成像研究发现，头皮上记录的纺锤波功率与海马体中的BOLD激活强烈相关，与此同时，特定类别的大脑区域被激活，这表明之前学习到的信息被重新激活。值得注意的是，这种纺锤体-bold相关性在海马体后部最强，在那里我们也观察到相对纺锤体最大值(补充图1)。最后，在啮齿类动物中，海马波纹一直与之前经历的重现有关，其受损会损害空间记忆，最近在人类中进行的iEEG研究表明，人类内侧颞叶中记录的波纹的数量与后来的记忆表现相关。简而言之，每一次非快速眼动睡眠振荡都与记忆表现有关。然而，仍有待确定的是，最终是否可能是它们的系统相互作用反映了睡眠期间的有效重新激活和巩固。

总之，利用这个难得的机会直接记录自然睡眠期间的人类海马体，我们发现了非快速眼动睡眠的基本特征之间复杂的关系。海马波纹嵌套在睡眠纺锤波的波谷中，而睡眠纺锤波又受SOs相位的调节。正如现有的系统巩固模型所表明的那样，这种功能耦合层次可能为睡眠期间海马体和新皮质之间的时间微调通信提供了一个重要的机制。

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