linux设计引物探针,如何设计荧光定量PCR的引物及TaqMan探针
对于做分子实验的人来说,探针引物,一个很熟悉的词语,科研人员也会经常用到,但是对于探针引物的设计,您知道多少?今天,我们就简单的谈下这种引物的设计。
通用原则
1. 先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近于探针;
2. 扩增子的长度应不超过400bp,理想的最好能在100-150bp内,扩增片断越短,有效的扩增反应就越容易获得,较短的扩增片断也容易保证分析的一致性;
3. 保持GC含量在20%和80%之间,GC富含区容易产生非特异反应,从而会导致扩增效率的降低,及在SG分析中非特异信号;
4. 为了保证效率和重复性,应避免重复的核苷酸序列,尤其是G(不能有4个连续的G);
5. 将引物和探针互相进行配对检测,以避免二聚体和发卡结构的形成。
探针设计指导
1. 在设计引物之前设计探针;
2. 探针的Tm值应在68-70℃之间,如果是目测探针,则要仔细审查GC富含区;
3. 探针的5’端要避免有鸟氨酸,5’G会有淬灭作用,即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在;
4. 选择C多于G的链作探针,G的含量多于C会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。
5. 探针应尽可能的短,不要超过30个bp。
6. 检测探针的DNA折叠和二级结构。
引物设计指导
1. 引物的Tm值应在58-60℃之间,这非常重要,因为我们的试验一般都使用退火温度为60℃,在这个温度下,5’核酸外切酶的活性最高。
2. 引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。
3. 将引物尽量接近于探针
循环参数
当引物和探针按照上述原则设计好后,循环的参数也就确定了,当经过起始的变性温度后(根据Tag酶要求设定),反应要经过95℃,15-20秒,60℃,60秒,对于一些模板,45秒也足够了,数据在退火时检测。
优化探针和引物的浓度
对于双探针反应,通过选择探针和引物的浓度来优化反应结果,能获得最低的CT值,以及相对于背景来说荧光值有最高的增长。引物浓度应该在50nM-900nM 范围内进行优化,探针浓度应该在50-250nM范围内优。探针的浓度应该从(50,100,250nM)与引物浓度相组合,在Rotor-Gene上进行试验,选择最小CT值和最高反应扩增的曲线做后续试验。
通常所用的探针和引物浓度分别为250nM 和900nM,绝大多数反应都可以在这个浓度下进行,但为了寻找最佳的浓度,还是应该依照上述的步骤。由于引物溶解温度预测的差异和多种探针设计程序,因此使用三种退火温度(58℃,60℃,62℃)对优化是很有用的。引物的浓度也会影响溶解温度,高的引物浓度会让溶解温度提高2度左右。Primer3是个非常有用的软件,但它不能避免3‘端的G,所以应将3’端的G去除,并观察探针的退火温度是否比引物高8-10度。
定量数据的分析
分析定量数据主要有两种基本的方法:绝对定量和相对定量。研究人员应该根据扩增子和试验目的来决定如何分析定量数据。
(1)绝对定量
绝对定量是将未知样品与标准曲线相比较进行分析,一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA样品,关于何种标准品用于标准曲线一直有很多讨论,理想的标准品其扩增方式应该是与待测样品一致得,然而这往往是不可能的。一些人会克隆他们得目的基因,并与未知样品比较。要注意得是,绝对定量分析的准确性是依靠标准品的准确性得。
在Rotro-Gene 上可以用几种方法来分析绝对定量数据。包括标准曲线在内的R值,反应效率都会被呈现出来。也可以从以外的分析中调用标准曲线并让它与一个标准品相调整,(或重复相同的标准品),这个功能在确定斜率的重复性好与Y截距的基础上完成。对一个标准曲线来说,一个单独的标准品就已经足够了,也可以在不同的通道甚至一个通道内绘制多条标准曲线。
(2)相对定量
相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较,其结果是一个比率,没有确切的数字被检测道。一种检测基因表达相对定量的方法叫“比较CT值法(⊿⊿Ct)”,这种方法可以彻底不需要标准曲线,通过观察与一个动态相关对照比较的表达水平,从而可以将模板与增加的样品间进行相对定量。要使这种方法成功,目的及参照的动态范围应该相类似。相对的一个敏感的方法就是看⊿Ct(相同的起始模板浓度,两个扩增子的两个CT值的差异)随着不同稀释度的模板有什么变化。如果两个扩增子的反应效率大致相同,则the plot of log input amount versus ⊿Ct 将是一条水平线(斜率<0.01)。这意味着在初始模板浓度范围内,两个扩增子有相同的反应效率。如果检测发现效率不一致,则应该用标准曲线来对基因表达进行定量,或优化反应获得一个类似的效率。
linux设计引物探针,如何设计荧光定量PCR的引物及TaqMan探针相关推荐
- 荧光定量PCR检测法的原理和应用领域
一.荧光定量PCR原理 在PCR扩增反应体系中加入荧光基团就是荧光定量PCR(Real-time PCR),通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 ...
- 诺禾--实验篇之荧光定量 PCR(上)
首先,我们还是要一同温习一下何为荧光定量 PCR.荧光定量 PCR ( realtime fluorescence quantitative PCR,RTFQ PCR )是一种定量实验技术,经过荧光染 ...
- 【无标题】新冠病毒变异株检测——荧光定量PCR检测技术开发
一.新冠病毒简介 2019新型冠状病毒(2019-nCoV,世卫组织2020年1月命名:SARS-CoV-2,国际病毒分类委员会2020年2月11日命名)简称"新冠". 冠状病毒是 ...
- 常见荧光定量 PCR 检测方法比较
以参照物为标准,对 PCR 终产物进行分析或对 PC R过程进行监测,从而达到评估样本中靶基因的拷贝数,称为定量 PCR.定量 PCR 的可行性定量一般是在 PCR 扩增的指数期进行的.下面我们来看一 ...
- 超全荧光定量PCR应用常见问题
实时荧光定量技术是什么 20世界90年代由美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术(Real-time qPCR),其基本原理是在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光染料探 ...
- 荧光定量 PCR 要点解析
一.荧光定量 PCR 原理 荧光定量 PCR(Real-time PCR),是指在 PCR 扩增反应体系中加入荧光基团,通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行 ...
- 荧光定量PCR的优点和检测方法盘点
荧光定量PCR检测有以下优点: 1.高灵敏性:可检测单个细胞基因: 2.高特异性和精确性:将DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精准性融合,应用荧光探针和光电传导,直接探测基因扩增过程中荧光信号的变化, ...
- 荧光定量PCR:基因相对表达量计算方法
荧光定量PCR之后计算目的基因的相对表达量一般采用2-△△ct的方法.我们还是假设对照组和处理组各有三个生物学重复(即对照组3个cDNA样品cDNA1, cDNA2, cDNA3,处理组3个cDNA样 ...
- 不同实验样品在实时荧光定量PCR检测中要求有哪些?
实时荧光定量PCR被常用于检测生物样品,同时也是检测DNA.RNA含量的最普遍的方法,通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应软件可以对产物进行分 ...
- spss分析qpcr数据_实时荧光定量PCR的三种数据分析方法比较.doc
窑128窑热带病与寄生虫学 圆园12 年第 10 卷第 3 期 允燥怎则灶葬造 燥枣 栽则燥责蚤糟葬造 阅蚤泽藻葬泽藻泽 葬灶凿 孕葬则葬泽蚤贼燥造燥早赠 圆园12援 V燥l 10. 晕燥 3 doi ...
最新文章
- java 如何计算数据库_java – 如何在我的数据库中计算这些变量?
- Python 线程----线程方法,线程事件,线程队列,线程池,GIL锁,协程,Greenlet
- 4代hiv检测50元_闲置甩干机卖了50元!大爷突然想起:里面还有4根金条
- python 队列与栈的实现
- 魅族17系列邀请函来了:防爆盾外观实锤 或4月15日亮相
- php soap proxy host,php-PHP soap Could not connect to host
- 性能优化之电量和网络
- Android mc怎么和win10联机,大更新我的世界手机版/win10版联机完美互通
- agv机器人无人仓系统-opentcs算法改进
- 翻译记忆软件-塔多思TRADOS经典教程_1
- 笔记本电脑如何安装Linux系统
- @Resource注解用法
- pythoninterpreter_java-Jython :: PythonInterpreter可以使用哪些模块...
- html嵌入虎牙直播功能,虎牙开放平台-年轻人喜爱的互动直播平台,直播帮助,直播教程,虎牙直播...
- c语言:输入三角形的三边,判断是否是直角三角形
- 190108每日一句
- 唯众本科Web前端专业解决方案
- C#的Linq to SQL
- gmssl国密sm2(生成密钥对-私钥签字-证书验签)
- 《iOS开发全然上手——使用iOS 7和Xcode 5开发移动与平板应用》之Objective-C新手训练营...
热门文章
- 《深入理解JAVA虚拟机》周志明 第三版 - 第三章 垃圾收集器与内存分配策略
- 人工智能白皮书 附下载地址
- 最新软件外包公司排名-中国IT人力外包公司排名
- WPF DataGrid 数据绑定
- 功能架构图、信息结构图、产品结构图的区别和绘制方法
- 027:vue+openlayers加载远程shp数据(示例代码)
- 李佳琦薇娅直播预告等微博文章采集转链
- excel求回归直线方程的公式_“如何在excel中求解任意直线的方程“excel绘制线性回归方程...
- Eclipse的安装
- Unity3d笔试题大全