超全荧光定量PCR应用常见问题
实时荧光定量技术是什么
20世界90年代由美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术(Real-time qPCR),其基本原理是在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光染料探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程。荧光定量PCR最大的优势可以对初始模板进行定量,目前已广泛应用于生命科学、医学研究等领域。
小编总结荧光定量PCR常见问题打包给各位 ,现整理如下,请大家批评指正。
常见问题罗列
没有CT值
实验结果一旦遇到没有Ct值情况,就要在第一时间排查是否有以下问题:
(1)循环数不够(但是一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);
(2)PCR程序设置不对,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;
(3)引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;
(4)模板量可能降解或上样量不足(但一般不超过500ng,根据试剂盒说明书即可),对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样品准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样品小量分装储备,避免反复冻融;
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