使用BRAKER2进行基因组注释

BRAKER2是一个基因组注释流程，能够组合GeneMark，AUGUSTUS和转录组数据。

在使用软件之前，有几点需要注意下

尽量提供高质量的基因组。目前随着三代测序价格下降，这一点问题不大。
基因组命名应该简单，最好就是">contig1"或">tig000001"
基因组需要屏蔽重复序列
默认参数通常表现效果就很好，但是也要根据物种来
一定要对注释结果进行检查，别直接使用

软件安装

BRAKER的依赖软件不少，且Perl需要安装的模块也很多，我们用conda能解决这些问题(需要添加bioconda频道)

conda create -n braker2 braker2

安装结束后会输出一些提示信息，汇总以下就是

保证AUGUSTUS的config目录能够有可写权限（自己用conda安装不需要考虑这个问题）
GeneMark和GenomeThreader还需要额外下载安装

我们一定要安装的就是GeneMark，需要从下载安装，然后添加环境变量

export GENEMARK_PATH=/your_path_to_GeneMark-ET/gmes_petap/

此外还有一些BRAKER2建议的软件，conda没有安装，需要自己按需安装

DIAMOND 0.9.24: 替代NCBI-BLAST
cdbfasta 0.99: 纠正AUGUSTUS预测的开放阅读框内内含有终止密码子的基因
cdbyank 0.981: 纠正AUGUSTUS预测的开放阅读框内内含有终止密码子的基因
GenomeThreader: 仅在你需要用蛋白数据进行注释时，才需要

关于这些conda未安装的软件参考

以cdbfasta和cdbyank为例

git clone https://github.com/gpertea/cdbfasta.git
cd cdbfasta
make all

之后可以添加到环境变量

 export CDBTOOLS_PATH=/path/to/cdbfasta/

也可以复制到conda建立的braker2的环境中，其中~/miniconda3是我conda的路径

cp cdbfasta cdbyank perltest.pl ~/miniconda3/envs/braker2/bin

安装完成之后，建议现运行下面这一步检查软件依赖

 braker.pl --checkSoftware

软件运行

BRAKER根据数据类型，有不同的运行模式，但根据现状其实最常见的情况是测了一个基因组，并且还测了二代的转录组，或许还有一些近缘物种的蛋白序列。因此假设你手头有下面这些数据

基因组序列: genome.fasta
转录组数据: XX1.fq.gz, XX2.fq.gz
蛋白序列: proteins.fa

第一步: 屏蔽基因组中的重复序列，这一步参考使用RepeatModeler和RepeatMasker注释基因组重复序列

RepeatMasker -xsmall -species arabidopsis -pa 40 -e ncbi  -dir . genome.fasta
#-xsmall: soft-mask

这一步输出的genome.fasta.masked将是后续注释的输入

第二步: 使用STAR将FastQ比对到参考基因组，STAR使用说明参考「RNA-seq分析软件」RNA-seq比对工具STAR学习笔记

mkdir -p STAR
# 建立索引
STAR \--runThreadN 20 \--runMode genomeGenerate \--genomeDir STAR \--genomeFastaFiles genome.fasta
# 比对
STAR \--genomeDir STAR \--runThreadN 20 \--readFilesIn XX_1.fq.gz, XX_2.fq.gz \--readFilesCommand zcat \--outFileNamePrefix xx_ \--outSAMtype BAM SortedByCoordinate \--outBAMsortingThreadN 10 \--outSAMstrandField intronMotif \--outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonical
mv xx_Aligned.sortedByCoord.out.bam xx.bam

输入结果为 xx.bam 如果测了多个组装的转录组，为每个样本运行一次比对生成多个BAM文件。

第三步: 运行BRAKER2

braker.pl --cores 48 --species=yourSpecies --genome=genome.fasta.masked \--softmasking --bam=xx.bam \--prot_seq=proteins.fa --prg=exonerate \--gff3

braker.pl最多支持48个线程。

最终会输出蛋白序列和CDS序列以及GFF文件

可能问题

使用conda安装时可能会出现的问题

Error in file bamToWig.py at line 172: Return code of subprocess was 127

原因是因为faToTwoBit程序出错

faToTwoBit
faToTwoBit: error while loading shared libraries: libssl.so.1.0.0: cannot open shared object file: No such file or directory

这是因为conda没能正确处理依赖关系，openssl版本过高，解决方法如下

# 建立软链接
cd ~/miniconda3/envs/braker2/lib
ln -s libssl.so libssl.so.1.0.0
ln -s libcrypto.so libcrypto.so.1.0.0

运行时出现如下警告

OpenBLAS blas_thread_init: RLIMIT_NPROC 4096

无视掉

参考资料

BRAKER2官方教程: https://github.com/Gaius-Augustus/BRAKER

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