Per tile sequence quality

Per tile sequence quality —Position specific failures of flowcells

介绍

当Per tile sequence quality显示fail或者warning，表明测序的lane或某个run中出现出现了部分故障，从而影响一些特定的区域和循环，进而使测序数据的质量下降。另外，如果read的3’端的质量是好的，就意味着存在瞬时质量损失(Transient quality loss)的区域难以被剪切处理。

Patterned Flow Cell Technology

设备	Read sequences per lane	Read length	设备运行时长
HiSeq 2500	150 -180 million reads x 8 lanes	100 bp single read or paired end	5 days for single read 11 days for paired end
MiSeq	12-15 million reads x 1 lane	150 bp single read or paired end	24-36 hours for both

基本 Illumina NGS workflow

1) 文库制备（library preparation）

2) 簇的生成（cluster generation）

3) 测序 (sequencing)

4) 比对和数据分析(alignment and data analysis)。

Illumina 测序方法的基本流程如下:

A single base containing a fluorophore and 3’ blocking moiety is incorporated by a polymerase.
The flow cell is imaged using fluorescent microscopy.
The fluorescent and blocking moieties are cleaved, allowing the next base to be incorporated.

flow cell 的结构

具有patterned flow cell 的测序技术的两个突破性的创新点：

1) a distinct, ordered nanowell design, Each nanowell contains DNA probes used to capture prepared DNA strands for amplification during cluster generation

2) a new exclusion amplification chemistry

这里写图片描述

症状和诊断

在illumina 的测序设备中，根据flow cell的表面，人为的将其切分为swaths，这些swaths再进一步被切分为tiles。通过查看per tile，识别因flow cell 或 run的故障造成的测序的错误。

症状一：random loss of quality at different positions and cycles

原因：overloading of the flow cell

症状二：a broad loss of quality over 4 areas of the flowcell

原因：当run的总体质量有点略低，而flowcell并没有过载时，造成这种错误的原因一般是由于测序的序列有偏差(biased)。这些高亮的区域代表flow cell 的边边，因为在flow cell 的边边，拍照系统识别read的信号的能力下降。一般而言，这些数据还不是太糟糕，常常还是能用的。

症状三：a quality loss in specific areas which is not present from the start but remains for the remainder of the run

原因：拍照系统受到阻挡，比如说，有脏东西掉在flowcell的表面，或者一些东西被冲进了flowcell，并且卡在flowcell内。通常这种阻塞现象会成对出现，因为任何阻碍物都会影响swaths的顶端和底端，来自这些区域的序列通常在质控中能被修剪移除掉。

症状四：a temporary loss of quality over a restricted area

原因：有些东西被冲进了flowcell中，阻塞了一些循环(cycles)，最后又被冲洗出去了。处理这个问题的难点在于，由于这段测序质量差的序列并不在read的末端，则意味着不能通过直接剪切处理这个read。

一般造成这个问题的主要原因是flowcell中的气泡。同时，气泡还会引起其他的副作用，如气泡不仅阻止拍照系统正确拍照，还使测序试剂无法流入flowcell的纳米孔中，进而无法形成cluster，从而导致气泡下的cluster跳过了 sequencing chemistry cycles，使得在气泡被引入之前的最后一个碱基被重复读取，最终导致序列被人为的延伸，即引入了插入片段。如果这些reads是用于检测SNP的，那么这些假的插入片段将会混淆对下游分析结果解释。

缓解上述症状的方法

一般在下游分析时，flowcell中质量低的 tiles 是可被移除的。或者可以根据QC报告中tile position，过滤或移除fastqc文件中低质量的tile。

预防措施

除标准除气和清洁工作程序之外，执行位置和一般质量检查(positional and general quality checks)都会使用户发现问题所在。

经验教训

即使是很小的数据子集，也有明显的质量损失，因为它们有可能在下游分析中引入重要的生物噪声。

软件

FastQC per-tile quality plot 和 the BamQC per-base indel plot 会找出问题类型

参考链接：

Illumina Sequencing Platform

Position specific failures of flowcells

Patterned Flow Cell Technology

https://www.broadinstitute.org/files/shared/illuminavids/sequencingSlides.pdf