FastQC使用与结果详细解读

一、FastQC用法

简单用法

fastqc -o outputfile inputfile

重要参数

-o 结果文件输出路径，需要自己事先建立好文件夹，默认输出文件是压缩文件，加--noextract则不压缩
-t 设置所使用的核数
-f 强制指定输入文件格式，默认自动检测
-c 污染物选项，输入的是一个文件，格式是Name[Tab] Sequence，#开头的行是注释，里面是可能的污染序列，如果有这个选项，FastQC会在计算时候评估污染的情况，并在统计的时候进行分析
-q 会进入沉默模式，指定这个选项的时候，程序不会实时报告运行的状况

二、FastQC结果详细解读

输出结果有一个.html问价和一个压缩文件，.html文件用浏览器打开即可得到FastQC Report

Summary

绿色：PASS
黄色：WARN（需要查看结果）
红色：FALL
Basic Statistics：基本信息统计

Filename : 文件名
File type : 文件类型
Encoding : 测序平台的版本和相应的编码版本号，用于计算Phred反推error P时用
Total Sequences : 输入文本的reads数量
Sequence flagged as poor quality : 测序长度
Sequence length : 测序长度
%GC : 表示整体序列的GC含量，由于二代测序GC偏好性高，GC含量会高
Per base sequence quality：序列测序质量统计

横轴为read长度，纵轴为质量得分，Q = -10*log(error P)，Q20表示1%的错误率，Q30表示0.1%的错误率；
柱状表示该位置所有序列的测序质量的统计，柱状是25%-75%区间质量分布，error bar 是10%-90%区间质量分布，蓝线表示平均数；
一般要求所有位置的10%分位数大于20，即最多允许该位置10%的序列低于Q20。当任何碱基质量低于10，或者任何中位数低于25报告WARN，当任何碱基质量低于5或任何中位数低于20报告FALL。
Per tile sequence quality：每个tile的序列质量

每个tile的测序质量，横坐标表示序列的长度位置从1到N，纵坐标是tile的编号，蓝色表示测序质量很好，颜色越红越不好
Per sequence quality scores：序列的测序质量

横轴：Q值
纵轴：每个Q值对应的read数
用来查看碱基质量是否存在普遍过低的情况，绝大部分的碱基的Q值的峰值大于20，可判断序列质量较好，在质量较低的坐标位置出现另一个或多个峰，说明测序数据中有一部分序列质量较差，当峰值小于27(错误率20%)时报WARN，当峰值小于20(错误率1%)时报FALL
Per base sequence content：序列的测序质量

横轴：各碱基位置
纵轴：碱基百分比
四条线四种颜色代表四种碱基在每个位置的平均含量（一个位置会测很多reads，然后求一个平均）
一般来讲，A=T，C=G，但是由于刚开始测序仪状态不稳定，造成前几个碱基有波动。一般不是波动特别大的，像这里cut掉前5bp就好了。另外如果A、T或C、G间出现偏差，只要在1%以内都是可以接受的。
Per sequence GC content

横轴：平均GC含量
纵轴：每个GC含量对应的序列含量
蓝线为系统计算得到的理论分布；红线为测量值，二者越接近越好
偏离理论分布的reads超过15%时，报WARN，超过30%时，报FALL

曲线和蓝线不一致可能的情况有：

如果出现两个或多个峰值，表明测序数据里可能有其他来源的DNA序列污染，或者有接头的二聚体污染；
曲线形状的偏差往往时由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差（overrepresented reads）；
形状接近正态分布但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差；

Per base N content：统计reads每个位置N的比率

N是指一起不能识别ATCG时给出的结果，一般不会出现。但是如果出现并且量还很大，应该就是测序系统或者试剂的问题
任意位置的N的比例超过5%，报WARN，超过20%，报FALL
Sequence Length Distribution：reads的长度分布

理想情况下，测得的序列长度应该是相等的，实际情况上总有些偏差
当reads长度不一致时报WARN，当有长度为0的read时报FALL
Sequence Diplication Levels：重复reads的次数统计

横轴：duplication的次数
纵轴：duplicated reads的数目（红线）
以unique reads的总数作为100%，上图的情况中，相当于unique reads数目的15%的reads是观察到两次重复的，大约3%是观察到3次重复的，以此类推
测序深度越深，越容易产生一定程度的重复，但重复程度很高，可能是有偏差的存在（如建库过程中的PCR duplication）。
FastQC中用测序数据的前200000条reads统计其在全部数据中的重复情况
当非unique的reads占总数的比例大于20%时，报WARN，大于50%时，报FALL
Overrepresented sequences：大量重复序列

如果有某个序列大量出现，就叫做over-represented，FastQC的标准是占全部reads的0.1%以上，为计算方便只取测序数据的前200000条reads进行统计，所以有可能over-represented reads不在里面。而>75bp的reads也是只取50bp。若在运行时加入-c contaminant file，出现的over-represented sequence会从contaminant file里面照匹配的hie（至少20bp且最多一个mismatch）
发现超总数0.1%的reads报WARN，超过总数1%报FALL

Adapter Content：接头含量

表示序列中两端adapter的情况
软件中内置了四种常用的测序接头序列，fastqc有一个参数-a可以自定义接头序列
此图中使用的illumina universal adapter并未去除，后期再使用cutadapt去接头
-Kmer content：重复短序列
在序列中某些特征的短序列重复出现的次数

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