摘  要：目的  基于指纹图谱和网络药理学分析预测当归四逆汤(DSD)中桂枝的质量标志物(Q-marker)。方法 建立桂枝水煎液和DSD的指纹图谱，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012年版)进行分析；采用网络药理学筛选和分析桂枝相关成分的作用靶点和通路，构建“成分-靶点-通路”网络，预测DSD中桂枝潜在的Q-marker。结果 建立了15批桂枝水煎液和15批DSD的指纹图谱，相似度均＞0.96，并指认出7个共有成分，分别为原儿茶酸、香豆素、肉桂酸、桂皮醛、桂皮醇、2-甲氧基肉桂酸和2-甲氧基桂皮醛；通过网络药理学筛选出桂枝的5个活性成分、7个核心靶点和15条关键通路；基于Q-marker“五原则”分析预测2-甲氧基桂皮醛、桂皮醛、肉桂酸为其潜在的Q-marker。结论 通过指纹图谱和网络药理学分析预测DSD中桂枝的Q-marker，为全面控制DSD的质量提供依据，为进一步研究DSD的作用机制提供参考，同时为经典名方中复方及单味药的Q-marker的关联性研究提供示范。

当归四逆汤(DSD)是张仲景《伤寒论》中的经典名方之一。《伤寒论》第351条言：“手足厥寒，脉细欲绝者，当归四逆汤主之。”DSD由当归、桂枝、白芍、细辛、甘草、木通、大枣7味药组成，具有温运血行、散寒通脉等功效，主治血虚寒厥证^[1-2]。现代临床在内科、外科、妇科等疾病上都有广泛的应用，主要用于治疗痛经、糖尿病周围神经病变、肿瘤、肾病、慢性肺源性心脏病、胃炎和荨麻疹等疾病^[3-10]。方中桂枝辛温，温经散寒以通脉，与当归共为君药；白芍、细辛共为臣药，助桂枝温通血脉。桂枝来源于樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl. 的干燥嫩枝，味辛、甘，性温，具有发汗解肌、温通经脉、助阳化气、平冲降气之功效，主要用于风寒感冒、脘腹冷痛、血寒经闭、关节痹痛、痰饮、水肿、心悸、奔豚等症^[11]。研究表明，桂枝在临床上一般用于治疗肿瘤、类风湿关节炎、痛经、糖尿病周围神经病变、心血管、痉挛等疾病^[12-14]。

中药质量标志物(Q-marker)是刘昌孝院士^[15-16]于2016年针对中药生物属性、制造过程及配伍理论等特点提出的新概念，是中药质量评价与控制的核心概念。Q-marker具有有效性、特有性、传递与溯源性、可测性和处方配伍“五原则”的特点，能够反映中药的安全性和有效性，有利于建立中药全程质量控制及质量溯源体系。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，具有整体性和模糊性的特点，能够反映中药及其制剂内在质量的稳定性和均一性，是控制水煎液、复方制剂等失去中药外表特征的中药制剂的有效手段^[17-18]。中药和复方制剂成分复杂，具有多成分、多靶点及多通路的特点，使其作用机制研究困难。网络药理学具有系统性与整体性的特点，运用网络药理学对中药进行系统分析，有助于反映及阐释中药的活性成分与靶点之间的作用关系^[19-22]。本研究通过建立桂枝水煎液和DSD的指纹图谱，采用指纹图谱和网络药理学相结合的方法分析预测DSD中桂枝的Q-marker，为全面控制DSD的质量提供依据，为进一步研究DSD的作用机制提供参考，同时为经典名方中复方与单味药的Q-marker的关联性研究提供示范。

1  仪器与试药

1.1  仪器

Waterse 2695型高效液相色谱仪，包括四元泵、柱温箱、自动进样器、PDA检测器和Empower工作站(美国Waters公司)；MS-105D型1/10万电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；TD5001C型电子天平(天津天马衡基仪器有限公司)；KQ-500B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；H1650-W型台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.2  试药

桂皮醛(批号SSELDLI，质量分数＞98%)购自东京化成工业株式会社；肉桂酸(批号AA0807DA14，质量分数≥98%)、桂皮醇(批号Y04N7C23850，质量分数≥98%)、香豆素(批号Y29M9C57109，质量分数≥98%)、原儿茶酸(批号H21J9Z64031，质量分数≥98%)、2-甲氧基肉桂酸(批号RA0424FA14，质量分数≥98%)、2-甲氧基桂皮醛(批号S28D9G78359，质量分数≥98%)均购自上海源叶生物科技有限公司。乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；其他试剂均为分析纯。

DSD由当归、桂枝、白芍、细辛、甘草、木通和大枣7味药组成，均购自于道地产区或主产区。每味药共收集不少于3个产地，总批次不少于15批。本实验前期已按照《中国药典》2015年版项下各味药的检测方法和检测要求对药材进行检测，选出优质产地的药材，并按照《中国药典》2015年版项下炮制方法将药材炮制成饮片。当归(甘肃岷县，批号TA180074001)；桂枝(广西东兴，批号TA180185001～TA180199001)；白芍(安徽亳州，批号TA180099001)；细辛(辽宁新宾，批号TA180145001)；甘草(甘肃陇西，批号GC17111412)；木通(河南洛阳，批号MT2019030505)；大枣(山西闻喜，批号DZ1807162)。经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定分别为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.) Diels. 的干燥根、樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl. 的干燥嫩枝、毛莨科植物芍药Paeonia lactifloraPall. 的干燥根、马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoidesFr. Schmidt var. mandshuricum (Maxim.)Kitag. 的干燥根和根茎、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch. 的干燥根和根茎、木通科植物木通三叶木通Akebia trifoliata (Thunb.) Koidz. 的干燥藤茎和鼠李科植物枣Ziziphus jujuba Mill. 的干燥成熟果实。本实验共研究桂枝和DSD各15个批次。

2  方法与结果

2.1  色谱条件

色谱柱：Merck Purospher Star LP RP-₁₈ endcapped(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)；梯度洗脱：0～8 min，5%～10% A；8～15 min，10%～13% A；15～24 min，13%～15% A；24～28 min，15%～17% A；28～32 min，17%～20% A；32～40 min，20%～30% A；40～47 min，30%～45% A；47～60 min，45%～70% A；60～75 min，70%～95% A；体积流量1.0mL/min；检测波长270nm；柱温30 ℃；进样量10μL。

2.2  对照品溶液的制备

分别取桂皮醛、肉桂酸、香豆素、原儿茶酸、桂皮醇、2-甲氧基桂皮醛、2-甲氧基肉桂酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释，得到质量浓度分别为0.300、2.525、2.250、0.613、0.325、1.473、0.316 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3  样品的制备

DSD出自于东汉•张仲景《伤寒论》，原方组成：“当归三两，桂枝三两(去皮)，芍药三两，细辛三两，甘草二两(炙)，通草二两，大枣二十五枚(擘)”。用法用量：“上七味，以水八升，煮取三升，去滓，温服一升，日三服”。经文献资料考证，按一两等于3 g，大枣二十五枚为8枚(约62.5 g)，一升等于200 mL，称取处方药味置陶瓷锅中，加水1 600 mL，加盖，武火煮沸并保持微沸煎至600 mL，以80目筛网滤过，绞渣，即得。按照煎煮方法，煎煮得到15批DSD(编号D1～D15)、15批桂枝水煎液(编号S1～S15)和1批缺桂枝阴性水煎液(编号YX)。

2.4  供试品溶液的制备

分别取桂枝水煎液、DSD和缺桂枝阴性水煎液摇匀，精密量取3 mL，置10 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5  方法学考察

2.5.1  参照峰选择  肉桂酸是桂枝的主要成分之一，化学性质稳定，峰面积较大，色谱峰保留时间稳定，故选择肉桂酸作为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间。

2.5.2  精密度试验  取DSD(D1)，按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，计算共有峰的相对峰面积和相对保留时间。结果显示共有峰的相对峰面积RSD＜2.8%，相对保留时间RSD＜0.14%，表明仪器精密度良好。

2.5.3  稳定性试验  取DSD(D1)，按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、24、48 h按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，计算共有峰的相对峰面积和相对保留时间。结果显示共有峰的相对峰面积RSD＜3.0%，相对保留时间RSD＜0.54%，表明DSD在48 h内稳定性良好。

2.5.4  重复性试验  取DSD(D1)，按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，计算共有峰的相对峰面积和相对保留时间。结果显示共有峰的相对峰面积RSD＜3.0%，相对保留时间RSD＜0.11%，表明该方法重复性良好。

2.6  指纹图谱的建立与相关性分析

2.6.1  桂枝水煎液和DSD指纹图谱的建立  取15批桂枝水煎液和15批DSD，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012年版)，分别以S1和D1为参照图谱，采用中位数法，得到15批桂枝水煎液和15批DSD的指纹图谱叠加图，结果见图1、2。

2.6.2  桂枝水煎液和DSD相似度分析  将15批桂枝水煎液和15批DSD的指纹图谱均导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012年版)，计算相似度，结果见表1。15批桂枝水煎液和15批DSD的指纹图谱相似度均＞0.96，表明桂枝水煎液和DSD的质量稳定均一。

2.6.3  共有峰的指认及相关分析  根据指纹图谱分析结果，将DSD、桂枝水煎液、缺桂枝阴性水煎液和混合对照品的指纹图谱进行叠加，结果见图3。由图可知，桂枝水煎液共确定10个共有峰，DSD共确定29个共有峰，经对照品指认其中7个共有峰。7个共有峰分别为4号峰(原儿茶酸)、17号峰(香豆素)、20号峰(桂皮醇)、21号峰(肉桂酸)、22号峰(2-甲氧基肉桂酸)、23号峰(桂皮醛)和26号峰(2-甲氧基桂皮醛)。由于复方成分复杂，17号峰(香豆素)未达基线分离，19号峰和22号峰(2-甲氧基肉桂酸)在缺桂枝阴性水煎液中存在一定干扰。

2.7  基于“成分-靶点-通路”的网络药理学分析

2.7.1 中药靶点预测  通过检索中药系统药理数据库(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)、PubChem Compound数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)、Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)中香豆素、原儿茶酸、桂皮醇、肉桂酸、桂皮醛、2-甲氧基肉桂酸和2-甲氧基桂皮醛7个候选化合物的作用靶点，共得到与7个化合物相关的116个靶点。2.7.2蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络构建将筛选出的116个靶点，导入在线STRING 11.0数据库软件(https://string-db.org/cgi/input.pl)进行PPI网络分析，选择物种为“Homo sapiens”，蛋白交互参数评分值为“high confidence＞0.7”，隐藏网络中无联系的节点，其余参数设置不变，获得核心靶点PPI网络图(图4)，结果共获得116个节点，199条边。将PPI结果以TSV文本格式导入Cytoscape 3.7.1软件中，并利用Cytoscape 3.7.1软件中的“Network Analyzer”功能对PPI网络进行拓扑属性分析，计算选取“度值”(degree)，“介数中心性”(betweennesscentrality)和“接近中心性”(closenesscentrality)3个重要拓扑参数均大于中位数且degree≥9的靶点作为核心靶点。经筛选得到12个核心靶点，结果见表2。经分析发现，这12个靶点与肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、2-甲氧基桂皮醛、桂皮醛、香豆素和原儿茶酸6个成分有关。

2.7.3  GO功能富集分析和KEGG通路富集分析  利用David 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对12个潜在的核心靶点进行基因本体(GO)功能和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。GO功能富集分析主要包括基因产物细胞功能、分子功能和生物功能分析，对基因进行注释和分类；KEGG通路富集分析可以得到DSD中桂枝核心靶点的信号通路。GO和KEGG分析均根据P＜0.05表示具有统计学意义。

GO富集分析共获取24个GO条目，其中生物过程(BP)占16个、分子功能(MF)占4个、细胞组成(CC)占4个，根据显著性程度P＜0.05进行部分展示。BP主要富集在白细胞介素-12生物合成过程的正调控、神经递质分解代谢过程、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、炎症反应等；MF主要富集在血红素结合、铁离子结合、氧化还原酶活性等；CC主要富集在细胞质核周区。结果见表3。KEGG富集分析共得到26条通路，根据显著性程度P＜0.05，筛选得到15条相关通路，主要包括类固醇激素生物合成、化学致癌、酪氨酸代谢、色氨酸代谢等。结果见表4。

2.7.4  成分-靶点-通路网络构建  根据筛选得到的6个成分、12个靶点和15条通路，运用Cytoscape 3.7.1软件构建“成分-靶点-通路”网络图，结果见图5。根据Cytoscape 3.7.1软件对网络图进行分析，以化合物、靶点蛋白、信号通路的连接度为参考，发现肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、2-甲氧基桂皮醛、桂皮醛、原儿茶酸的连接度相对较高，均可能是桂枝发挥药效的活性物质；MAOA、MMP9、TLR4、CYP1A2、PTGS2、CYP1B1、RELA的连接度较高，可能是桂枝发挥作用的关键靶点；15条信号通路的连接度差异不大，均可能是桂枝的关键信号通路。

3  整合分析

本研究通过建立桂枝水煎液和DSD的指纹图谱，指认其共有峰，对指认出的成分进行网络药理学分析，筛选得到桂枝的关键靶点和信号通路，运用Cytoscape 3.7.1软件构建“成分-靶点-通路”网络图，根据degree分析肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、2-甲氧基桂皮醛、桂皮醛和原儿茶酸5个成分均可能是桂枝发挥作用的活性成分。基于Q-marker的“五原则”进行分析，其中2-甲氧基肉桂酸在缺桂枝阴性水煎液图谱中存在一定干扰，原儿茶酸是桂枝和白芍的共有成分，肉桂酸、2-甲氧基桂皮醛、桂皮醛是桂枝的特有成分。结合指纹图谱和网络药理学对DSD中桂枝的Q-marker进行预测分析，初步预测桂皮醛、肉桂酸和2-甲氧基桂皮醛是DSD中桂枝潜在的Q-marker。

桂枝挥发油含量较高，主要成分为桂皮醛和2-甲氧基桂皮醛，其他有效成分为肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、桂皮醇、香豆素、β-谷甾醇、多聚体糖苷及多种二萜类化合物等^[23]。经研究发现，桂皮醛和2-甲氧基桂皮醛，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤和抗癌等作用；肉桂酸具有抗炎、抗菌、抗肿瘤和抗氧化能力等作用^[13,24]。Chao等^[25]经过研究发现桂枝挥发油能够减轻炎症反应，其作用于NF-κB通路，通过减轻炎症因子的产生来发挥作用。Ka等^[26]经过研究发现桂皮醛能够抑制人类早幼粒细胞白血病HL-60细胞，诱导细胞凋亡。临床研究表明，桂枝一般用于治疗肿瘤、类风湿关节炎、痛经、糖尿病周围神经病变、心血管、痉挛等疾病^[12-14]。利用BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/ batman-tcm/)查找发现DSD可通过调控TNF信号通路、HIF-1信号通路、5-羟色胺能突触、酪氨酸代谢、类固醇激素生物合成、癌症通路、色氨酸代谢、NF-κB信号通路、多巴胺能突触等信号通路进行疾病治疗。程邦^[27]经研究发现DSD通过调控TNF信号通路、HIF-1信号通路、癌症通路等信号通路干预类风湿性关节炎；程思宇^[28]经研究发现DSD通过调控NF-κB信号通路治疗糖尿病周围神经病变；刘泽宇等^[29]经研究发现DSD通过调控TNF信号通路、HIF-1信号通路等信号通路治疗肝细胞癌。综上分析，推测TNF信号通路、HIF-1信号通路、癌症通路、5-羟色胺能突触、酪氨酸代谢、类固醇激素生物合成、色氨酸代谢、多巴胺能突触和NF-κB信号通路均可能是桂枝在DSD中发挥作用的信号通路。

4  讨论

中药和复方制剂成分复杂，具有多成分、多靶点、多通路的特点，使其作用机制研究困难。中药指纹图谱是建立在中药化学成分系统研究的基础上，分析中药和复方制剂的化学成分类型，对中药进行整体质量控制；网络药理学基于疾病、基因、靶点、中药相互作用网络的基础上，进一步阐释中药的作用机制；质量标志物是中药质量评价与控制的指标，有利于建立中药全程质量控制及质量溯源体系。

本研究依据刘昌孝院士^[16]提出的“质量标志物”的理念，采用指纹图谱和网络药理学相结合的方法分析预测DSD中桂枝的Q-marker。通过建立桂枝水煎液和DSD的指纹图谱从传递和溯源性、可测性的角度对桂枝进行分析，指认出原儿茶酸、香豆素、桂皮醇、肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、桂皮醛和2-甲氧基桂皮醛7个成分，其中桂皮醇未达基线分离，2-甲氧基肉桂酸在缺桂枝阴性水煎液的指纹图谱中存在一定干扰；运用网络药理学从有效性的角度对其进行分析，发现肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、2-甲氧基桂皮醛、桂皮醛和原儿茶酸5个活性成分通过调控MAOA、MMP9、TLR4、CYP1A2、PTGS2、CYP1B1、RELA等关键靶点，作用于TNF信号通路、HIF-1信号通路、癌症通路、NF-κB信号通路、酪氨酸代谢等关键信号通路发挥桂枝治疗疾病的功效；从质量标志物特有性的角度进行分析，原儿茶酸是白芍和桂枝的共有成分，桂皮醛、肉桂酸和2-甲氧基桂皮醛是桂枝的特有成分。综上所述，初步预测桂皮醛、肉桂酸和2-甲氧基桂皮醛为DSD中桂枝潜在的Q-marker。为后期深入研究桂枝和DSD的作用机制提供参考，有助于建立全程质量控制体系，提高中药产业质量控制水平。

参考文献(略) 

来  源：   夏金鑫，梅  茜，郭  爽，严国俊，王巧晗，季  德，赵晓莉，陆兔林，毛春芹. 基于指纹图谱和网络药理学对当归四逆汤中桂枝的Q-marker预测分析 [J]. 中草药, 2020, 51(10): 2634-2633.