先下载 primer3 和 misa 相关文件

# 下载 primer3
conda search primer3
conda install -y primer3
# misa 相关的文件下载百度云里面的，其他网站的好像都不能用，自己改了一下之前的脚本可以正常运行

misa 相关文件放在百度云链接：https://pan.baidu.com/s/1C4eU30yyLr7iNGiuGEmPtg
提取码：dypg
文件包括misa.ini(参数设置), misa.pl(perl脚本)，p3_in.pl，p3_out.pl

misa.ini为SSR鉴定参数，默认：
definition(unit_size,min_repeats):1-10 2-6 3-5 4-5 5-5 6-5
interruptions(max_difference_for_2_SSRs):100
参数说明：1个碱基重复10次及10次以上；2个碱基重复6次及6次以上；3个碱基重复5次及5次以上；4个碱基重复5次及5次以上；5个碱基重复5次及5次以上；6碱基重复5次及5次以上的碱基重复序列算是微卫星序列。两个微卫星之间的距离小于100bp的时候，两个微卫星组成一个复合微卫星。

perl misa.pl test.fa
perl p3_in.pl test.fa.misa
##### primer3 设计引物
primer3_core -- default_version=1 -- output=test.fa.p3out test.fa.p3in
#### p3_out.pl 整理合并文件
perl p3_out.pl test.fa.p3out test.fa.misa

一对好引物的特征
1.GC含量 40-60%
2.退火温度 50-65℃
3.3'端最后5个碱基有G或C,但是不超过3个
4.引物长度推荐 17-28bp，最好不超过 30bp

一般而言，单碱基，四，五，六碱基的引物都不用，使用的一般是二碱基重复次数10次以上，三碱基重复次数6次以上的SSR