.

1

ELISA

操作流程

(一)

、基本操作流程

方法一

双抗体夹心法(用于检测未知抗原的)

1.

包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为

0.5

～

20

μ

g

／

ml

，按

100ul/

孔加入

酶标板，

4

℃包被过夜。

2.

洗板：

次日弃去孔内液体，

在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，

加入洗涤液

(约

280-300ul/

孔)

，漂洗

2-3

次，每次

3-5min

；

3.

封闭：按

200-250ul/

孔加入封闭液，室温

2-3

小时或

37

℃

1-2

小时，也可

4

℃封闭

过夜，然后弃去孔内封闭液；

4.

样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品

(

含未知抗原

)

稀释至所需浓度；

5.

标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度(定性分析可省略本

步骤)

；

6.

加样：按排列顺序依次加入

50-100ul/

孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、

阴性对照及阳性对照，室温或

37

℃孵育

30-60min

；

7.

洗板：同步骤

2

；

8.

加酶标抗体：酶标抗体的稀释按产品说明书，按

50-100ul/

孔加入新鲜配制的酶

标抗体，室温或

37

℃孵育

1

小时；

9.

洗板：同步骤

2

；

10.

加底物液显色：

按

100-150ul/

孔加入新配制的

TMB

底物溶液，

室温避光反应

15

～

30

分钟。

11.

终止反应：于各反应孔中加入

50ul

的终止液。

12.

结果判定：可于白色背景上，直接用裸眼观察结果，反应孔内颜色越深，阳性

程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“

+

”

、

“

-

”号表示。也可在酶

标仪上于

450nm(

若以

ABTS

显色，则

410nm)

处测

OD

值。检测时以空白对照孔调零后测

各孔

OD

值，若样品孔中的

OD

值大于阴性对照孔的

2.1

倍，即为阳性。

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