Microbiome | 宏基因组测序中减少样品中真核宿主的DNA污染

文献导读

与16S rRNA测序相比，使用鸟枪法宏基因组测序不仅可以更加深入地了解样本中微生物的分类和功能，也可以避免PCR扩增带来的偏差。然而，对于来源于真核宿主的样本来说，宿主DNA的污染不可避免。因此，使用鸟枪法进行微生物宏基因组测序时，测序深度往往会受到很大影响。如果能在测序之前去除样本中的宿主DNA，使用鸟枪法对微生物组测序的优势会进一步扩大。
目前清除宿主DNA的方法主要分为两类，分别需要在提取样品DNA之前和之后进行操作。前者通常需要两个步骤，即首先选择性裂解哺乳动物细胞，再使用酶法去除暴露的DNA，只留下微生物细胞进行下游分析。这种方法通常需要对样品进行多步洗涤操作，因此在清除宿主DNA的同时也会影响细菌群体的组成。第二种方法则在提取样品中的全部DNA之后，针对在真核生物中更常见的甲基化核苷酸进行操作。然而，当样品中存在于与宿主甲基化模式相似的真核微生物时，选择这种方法也将对微生物群落的构成造成影响。
本文作者优化了一种化学方法来达到清除真核宿主DNA的目的，即在选择性裂解宿主细胞后，通过PMA(propidium monoazide)与暴露的DNA结合，从而避免宿主DNA参与测序。

文献信息

英文标题：Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion
中文标题：用化学方法去除宿主DNA以改善唾液鸟枪法宏基因组测序
IF：9.133
年份：27 February 2018
期刊：Microbiome
通讯作者：Karsten Zengler
通讯地址：Department of Pediatrics, University of California San Diego, La Jolla, CA,
USA，Center for Microbiome Innovation, University of California San Diego, La
Jolla, CA, USA
Email: kzengler@ucsd.edu

实验原理与思路

PMA是一种可与DNA结合的染料，本身荧光较弱，但可优先与高亲和力的dsDNA结合，结合后荧光会显著增强。在可见光的诱导下，PMA分子的叠氮化物基团被光解并发生C-H插入反应并与DNA形成共价键，从而产生永久性的DNA修饰。这种染料无法通过功能完整的细胞膜，因此可以选择性地用来修饰来自死亡细胞的暴露DNA，同时保留来自活细胞的完整DNA。由于这一特性，PMA 常常在qPCR中被用来区分来源于死亡细胞和活细胞的DNA。在这项研究中，作者首先使用物理方法选择性裂解真核生物细胞使其DNA暴露，再诱导PMA与DNA结合，从而达到去除宿主DNA的目的。

source:https://biotium.com/product/pmatm-dye-propidium-monoazide/

实验方案

针对收集到的人类唾液样品，作者比较了5种去除宿主DNA的方法，包括：

5-μm filtration (Fil)

QIAamp DNA Microbiome Kit (QIA)

MolYsis™ Basic (Mol)

NEBNext® Microbiome DNA Enrichment Kit (NEB)

PMA

在使用不同方法清除宿主DNA之后，作者对不同唾液样品进行DNA提取和鸟枪法测序，并将结果与未处理过的唾液样品进行比较分析，从而得到不同方法清除宿主DNA的效率和对微生物群落的影响。

结果讨论

比较不同方法清除宿主DNA的效率

对所有五种方法来说，任何一种处理都能降低样品中宿主DNA的含量。使用Bowtie 2对每个样品中匹配到人类基因组的序列百分比分析发现，5µm过滤法和NEB试剂盒法均不能显著去除样品中的宿主DNA。与未经处理的样品相比，Mol（62.88±3.46％），QIA（29.17±5.04%）和PMA（8.53±2.08％）三种方法都可以显著降低样品中宿主DNA的含量（p < 0.0001）。在这三种方法之中，PMA表现最佳，其次是QIA，最后是Mol（p < 0.0001）。

比较不同方法对微生物群落组成影响

除了清除宿主DNA的不同方法之外，唾液样品中的微生物群落组成与样品来源也有关系。对于使用相同宿主DNA清除方法、来源于不同宿主的唾液样品来说，其Bray-Curtis差异性显著大于使用不同宿主DNA清除方法、来源于相同宿主的样品。在使用其他β多样性指标进行分析时，作者也发现了相似的结果。因此作者提出，为了比较不同DNA清除方法对微生物群落组成的影响，应当保证唾液样品的来源一致。

对来源相同的样品来说，使用不同DNA清除方法造成的Bray-Curtis差异性显著大于操作带来的差异。因此，作者认为不同DNA清除方法对微生物群落的组成有显著影响。通过比较不同DNA清除方法与相应原始样本之间的Bray-Curtis 差异，作者发现PMA法（0.273±0.011）和Fil法（0.226±0.009）处理过的样品与相应原始样品的组成相似性显著高于其他三种方法。为了找到受宿主DNA清除影响的细菌类别，作者又对宿主DNA清除样品和相应原始样品中每一个分类单元下的细菌相对丰度进行了两两比较，结果却没有发现任何一种受到显著影响的分类单元。

综上，作者得出的结论是，PMA法可以被用来清除唾液样品中的宿主DNA，并且不会对其中微生物群落组成造成显著影响。

思考

为了解决宿主DNA污染的问题，作者并没有提出一个新的方法，而是对PMA在qPCR中的常见应用进行了一点“延伸” 。当然，PMA法并不一定适用一切不同来源和不同的微生物组成的样品，但作者对实验设计的思路以及在其中考虑的因素都是值得借鉴的。

原文链接和参考文献

1.点击查看原文

2.Marotz, C. A., Sanders, J. G., Zuniga, C., Zaramela, L. S., Knight, R., & Zengler, K. (2018). Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion. Microbiome, 6(1), 42.

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