1 文章亮点

【1】 微塑料添加改变了沉积物微生物群落组成和氮循环过程。

【2】 PUF和PLA微塑料的添加促进了硝化和反硝化过程；PVC添加抑制这两个过程。

2 摘要

微塑料普遍存在于河口、沿海和深海沉积物中。然而，微塑料对沉积微生物生态系统和生物地球化学碳、氮循环的影响尚未得到很好的报道。为了研究微塑料对沉积微生物群落组成和功能的影响，我们采用聚乙烯(PE)、聚氯乙烯(PVC)、聚氨酯泡沫(PUF)或聚乳酸(PLA)微塑料对盐沼沉积物进行了微宇宙培养实验。我们发现微塑料的存在改变了沉积物微生物群落组成和氮循环过程。与没有微塑料的对照沉积物相比，经过PUF和PLA添加的沉积物促进硝化和反硝化，而PVC添加抑制这两个过程。这些结果表明，沉积物中的氮循环过程受到不同微塑料的显著影响，这些微塑料可能作为微生物群落的有机碳底物。考虑到这一证据和不断增加的微塑料污染，微塑料对全球生态系统和生物地球化学循环的影响值得进行关键的研究。

关键词：微塑料 | 微生物群落 | 氮循环功能基因 | 微生物多样性

3 研究背景

海洋环境中越来越多的塑料碎片是一个全球关注的问题。大碎片对个体生物的影响是显而易见的。微塑料(小于5毫米)和纳米塑料(小于1um)是最丰富的形式，但阐明它们的生物后果是具有挑战性的，而且对生态系统水平的影响还没有得到很好的证明。这种生态系统水平的效应可能会影响生物地球化学循环。此外，大多数研究都集中在地表水中的微塑料。尽管许多塑料具有浮力，但在生物淤积或融入海洋后，塑料微粒仍被运输到沉积物中。事实上，越来越多的研究已经在淡水、沿海甚至深海沉积物中发现了塑料微粒。因此，对沉积群落及其相关过程的影响值得研究。

尽管漂浮的塑料碎片和微生物(形成生物膜)之间的相互作用已经得到了很好的证明，但据我们所知，迄今为止只有三项研究研究了沉积物中塑料上生物膜的形成。Nauendorf等人研究了塑料(聚乙烯(PE)或可生物降解的聚酯)在富含有机物的海洋沉积物中的表面定植。他们观察到细菌在聚合物表面的快速定植，但没有描述其群落组成。Harrison等人研究了河口沉积物中PE(5×5×1mm)的表面定殖。利用16S rRNA基因扩增，他们发现不同沉积物类型(细砂、中砂和淤泥)的细菌组成不同，两个微生物属(Arcobacter和Colwellia)占已鉴定的总序列的84-93%。Pinne和turner使用宏基因组学研究了沉积物水界面上大微塑料(直径3-4毫米)生物膜的形成。这一研究发现，与对苯二甲酸PE (PET)相比，生物塑料(聚羟基烷酸酯，PHA)促进硫酸盐还原细菌的生长，而PET的生物膜与陶瓷颗粒对照没有显著差异。这些研究说明了生物膜在沉积物微塑料表面形成的能力。然而，一个尚未解决的问题是，微塑料(可能是一个顽固的碳库)的添加是否会改变沉积物中的整体微生物群落组成和生物地球化学循环过程。

在沿海盐沼中，微塑料对沉积物微生物群落的影响可能特别重要。这些系统直接接收来自土地径流、不良废物管理、雨水沟和污水溢流以及污水处理厂排放的微塑料。沼泽植被和水循环模式促进悬浮固体、有机物和微塑料的夹带和沉积。因此，沿海盐沼也是有机质矿化和生物地球化学循环极为活跃的区域。沉积物微生物群落以依赖于深度的级联作用来再矿化有机质。典型的双生过程始于薄层含氧层中最不稳定的有机质的降解，结束于缺氧层中较不稳定有机质的发酵。在这些微生物介导的分解代谢过程中，反硝化作用在去除沿海系统中过多的活性氮方面尤为重要。在有机质氧化过程中，反硝化作用发生在缺氧区，利用硝酸盐(NO3-)和亚硝酸盐(NO2-)作为终端电子受体。反硝化几乎和氧气呼吸途径一样节能。它的作用是通过将NO3-和NO2-转化为气态N物种，如氧化亚氮(N2O)和二氮(N2)来脱氮。一个同样重要的反应是硝化作用，发生在氧化区域，氧化铵(NH4+)为NO2-，然后氧化为NO3-。反硝化活性受到来自原位硝化作用或人为来源的NO3-和NO2-供应的限制。总的来说，这两种途径对于消除污染环境中的过量氮以及调节生态系统中的生产力都是至关重要的。据我们所知，这些无机氮形式对微塑料污染的响应仅在两项研究中得到了解决，而这两项研究都没有评估细菌群落组成在养分通量方面的作用。

在这里，我们研究了微塑料对沿海盐沼沉积物中微生物群落结构和功能(特别是硝化作用和反硝化作用)的影响。选用三种常见的石油基塑料进行分析:聚乙烯(PE)、聚氯乙烯(PVC)和聚氨酯泡沫塑料(PUF)。此外，用一种生物聚合物(聚乳酸，PLA)来比较一种可降解的聚合物和那些更难以降解聚合物的效果。为了评估潜在的影响在短期内沉积物的微生物群落,这些四种聚合物添加到沉积物微宇宙体系中培养了16天(图1)。沉积物微生物群落组成和多样性的变化评估基于16s rRNA基因的测序,同时测定硝化反硝化相关的功能基因定量。通过测定沉积物水中溶解无机氮浓度，推断沉积物氮循环过程。在培养结束后，进行了含N15标记的NO3-示踪剂的沉积物培养实验，以测量潜在的反硝化速率。从这些结果中，我们证明了沉积物微生物群落对微塑料的添加有不同的反应，在不同微塑料聚合物类型之间发生显著不同的群落结构和功能反应。

Fig. 1 Microcosm experimental design. All fifive treatments were repeated in triplicate and each microcosm was individually aerated to establish an oxygengradient in the sediment.

3.1微生物群落结构。

对16S reads的原始数据进行合并和过滤，共得到1,379,639条序列，平均每个样本得到44,504条序列。细菌16S序列在每个样品中占主导，古菌16S序列<2.21%，在进一步的分析中被去除。在生物聚合物(PLA)中，细菌多样性(alpha多样性)最高，在PE添加的沉积物中最低，在对照处理中其次(表1)。利用主坐标分析(principal coordinate analysis, PCoA)对样品间细菌群落多样性进行比较，该分析基于beta多样性衡量群落间的差异(图2)。利用bray-curtis差异分析，前两个主成分解释了32.7%的群落方差。使用PERMANOVA计算这些微生物群落差异之间的显著差异，以及这些差异之间的交互作用。PVC处理的沉积物群落与其他处理有明显差异。初始群落(实验开始时从均质沉积物中取样)和对照组和PLA处理中的群落聚集在左上象限。随着时间的推移，对照的微生物群落和PLA的变化极小，PE和PUF处理的群落组成变化最大，但两者之间存在相似性。这两种石油基聚合物处理对群落的影响与第三种石油基聚合物处理PVC有明显不同。聚氯乙烯处理与其他处理之间的细菌群落也有明显差异(补充图2)。

Fig. 2 Principal coordinate analysis of the sediment communities. Betadiversity was calculated using the Bray–Curtis dissimilarity index, and isplotted for all sample dates: initial (asterisk), 7 days (triangle), and 16 days(circle); and treatments: control (red; CON), PE (green), PVC (purple), PUF(orange), and PLA (blue).

在所有样品中，拟杆菌门和变形杆菌门的物种占优势(Supplementary Fig. 3)。在变形杆菌门中，群落中以Deltaproteobacteria和Gammaproteobacteria类占优势(Supplementary Fig.4)。各处理之间的群落组成差异显著，尤其是在科水平上。各处理组和对照组之间这些Family的相对丰度有显著差异。几个科的相对丰度在对照中显著高于PVC处理，包括染色菌科、外硫菌科、慢菌科、磁球菌科、倍藻科、sedimenticol科、热厌氧菌科和扁藻科。其中，Chromatiaceae和Sedimenticolaceae在PVC-amended中的相对丰度显著低于其他处理(补充图4)。在所有塑料处理中，Family_XII在群落中的丰度显著高于对照。在PE、PUF和PVC处理中，Izimaplasmataceae、Marinifilaceae和Marinilabiliaceae的相对丰度显著高于对照组，但没有显著不高于生物聚合物(PLA)处理。PVC添加后脱硫菌科和脱硫菌科的几个属显著高于其他处理(附图9-12)。差异最明显的处理PVC，包含了多个相对丰度显著高于其他处理群落的科，包括Acholeplasmataceae、Anaerolineaceae、Family_XII、Izimaplasmataceae、Lachnospiraceae和Marinilabiliaceae(补充图13)。

Fig. 3 Bacterial community composition and treatment effects.

3.2硝化和反硝化作用

在每个采样点，测定了水中的溶解无机氮形态(DIN)，包括NO3-、NO2-和NH4+的浓度(图4)。起始水中的NO3-、NO2-和NH4+的浓度较低(分别为0.072、0.527和3.44um的水平)。总的来说，在所有处理中，NH4+的浓度是NO3-和NO2-的3倍，而NO2-的浓度是NO3-的2倍。在16天PUF和PLA处理中，我们观察到NO2-和NO3-的含量最高，而NH4+在这些处理中含量最低(图4)。PE和对照处理在16天后的水中含有NO3-和NO2-，而PVC在所有时间点几乎没有检测到NO3-或NO2-。相比之下，PVC处理16天后水中NH4+最多。在PE、PUF和PLA处理中，NH4+在第7天大于第16天，与PVC和对照处理相反。我们还测量了PO43-水的浓度，在PVC处理中PO43-水的浓度最高(补充图14，补充表5)。

Fig. 4 Dissolved inorganic nitrogen concentrations in water. Concentrations (µM) of NO3− a, NO2− b, and NH4+ c are shown for each microplastictreatment and control microcosms after 7 and 16 days of incubation (n = 3 per treatment).

DIN浓度可以与基因丰度一起用于评估硝化和反硝化活动。与细菌硝化作用(amoA)和反硝化作用(nirS和nirK)通过基于qPCR进行定量。氨单加氧酶(由amoA基因编码)是硝化作用的关键酶，将氨(NH3+)氧化为羟胺(NH2OH)。图5显示了不同处理下amoA与16S的比值。我们针对的是氨氧化细菌，而不是氨氧化古菌(AOA)，因为样品的16S序列中没有检测到AOA类群。所有处理的细菌amoA基因丰度从第7天到第16天均增加，说明硝化作用潜力随时间增加。16天后，PLA和PUF处理的amoA基因丰度最高，表明有着最高的硝化潜力。而PVC处理中amoA基因丰度最低，这与NH4+随时间而积累相对应，说明该处理抑制了硝化作用。

nirS和nirK基因编码的亚硝酸盐还原酶是反硝化作用的关键酶。携带nirS基因的反硝化菌通常被认为是完全反硝化菌，将NO3-和NO2-转化为氮气(N2)。nirS和nirK基因(相对于细菌16S rRNA基因)的丰度随时间变化很小(图5)。对照组、PUF和PLA处理的nirS基因丰度最高，表明其反硝化活性高于PE和PVC处理。PVC始终表现出最低的nirS基因丰度，表明较低的反硝化活性。相反，在所有处理中，nirK丰度相对一致，但在16天后对照中略高。

Fig. 5 Nitrifification and denitrifification gene abundances. The genes encoding ammonia monooxygenase (amoA, a) and nitrite reductase (nirS, b, and nirK,c) were quantifified and normalized to 16S rRNA genes.

在16天的培养结束时，我们测量了反硝化潜力。PVC具有较低的潜在反硝化潜力，其与最低的nirS基因丰度相一致。反硝化作用可能在PLA和PUF中最高，它们具有较高的nirS基因丰度。PUF和PLA处理也有更多的反硝化底物(NO3- 和NO2-)。有趣的是，与PVC处理相比，对照处理的反硝化率明显低于PUF和PLA处理。这与对照中nirS和nirK基因丰度高于PVC处理不同，但可能是有效NO3-和NO2-底物相对于PUF和PLA较低的产物。厌氧氨氧化(anammox)的潜在速率在PLA和PUF中最高，在PVC和对照组中最低(补充图15;补充表10)。在培养结束时测定了沉积物有机C和N含量以及塑料本身含有的C和N，结果表明沉积物有机C的对照处理明显低于所有其他处理(补充表11和12)。此外，将反硝化和anammox的潜在速率与总DIN进行比较，以估计DIN的去除能力。这表明PVC和对照处理的DIN去除能力最低，而PLA和PUF的去除能力最高。

Fig. 6 Comparison of potential denitrifification rates. Potential denitrifificationrate for each treatment in nmol g−1 hr−1, calculated after the end of theexperiment (day 17).

4 参考文献

Seeley M E , Song B , Passie R , et al. Microplastics affect sedimentary microbial communities and nitrogen cycling[J]. Nature Communications, 2020, 11(1):2372.