与内在功能连接个体变异性相关的基因表达

摘要

研究表明，内在功能连接（FC）中的个体间变异性（ISV）与各种各样的认知和行为表现相关。然而，ISV在FC中的潜在组织原理及其相关基因转录谱尚不清楚。使用静息态功能磁共振成像数据从人类连接组计划（299年成人被试）和艾伦人类脑图谱的微阵列基因表达数据，我们进行了转录-神经成像关联研究调查内在的ISV的空间配置及其与空间基因转录谱的关联。我们发现，FC中多模态关联皮层的ISV最大，而单模态皮层和皮层下区域的ISV最小。重要的是，偏最小二乘回归分析显示，与人类加速区（HARs）相关的基因的转录谱可以解释FC中ISV空间分布的31.29%的变异。转录谱中的顶级相关基因在中枢神经系统的发育、神经发生和突触的细胞成分中得到了丰富。此外，我们还观察到，基因转录谱对FC中ISV的异质性分布的影响是由脑血流结构介导的。这些发现强调了ISV在FC中的空间排列，以及它们与转录谱和脑血流供应变化的耦合。

1.引言

人类大脑功能连接（FC）中的个体间变异性（ISV）是认知和行为方面的个体差异的基础。最近，静息态功能磁共振成像（R-fMRI）研究表明，成人和新生儿的FC均表现出显著的区域差异，表现为多模态关联皮层的ISV高于单模态皮层。这些FC中ISV较高的区域不仅可以预测个体在高阶认知功能（如认知抑制和流体智力）方面的差异，还可以为个体识别提供有价值的信息。此外，先前的研究表明，在新生儿大脑中检测到的FC中ISV的总体空间模式与在健康成年人中观察到的空间分布相似。在新生儿大脑和成人大脑之间的FC中，ISV的总体空间分布相似性强调了基因表达对FC中ISV空间分布的影响。此外，人类双胞胎研究表明FC是可遗传的。同卵双胞胎的FC相似性高于异卵双胞胎和非相关个体的相似性。然而，遗传因素对FC中ISV的异质性分布的作用机制仍不清楚。

先前研究已探索了人脑FC组织的遗传基础，通过比较同卵双胞胎、异卵双胞胎和非相关单胞胎对的FC变异性，估计了FC中ISV的遗传贡献。他们发现，基因共享程度的增加（同卵双胞胎为100%）与FC变异性的降低显著相关，这表明FC中的ISV有很强的遗传效应。以往关于FC中ISV的遗传贡献的研究主要揭示了FC的高遗传力，然而，哪些基因与ISV在FC中的异质性分布相关尚不清楚。通过比较基因组分析，Doan等人确定了人类加速区域（HARs）的基因组，这表明了人类与其他物种相比不同的加速扩散的基因组位点。位于人类加速区域的基因，被称为HAR基因，已被发现与神经元发育过程相关，如皮层扩张、神经发生和神经元分化，并调节人类特定的社会和行为特征。值得注意的是，HAR基因涉及整个人体的各种功能的影响，这并不是大脑特有的。Wei等人随后通过将HAR基因集与脑基因集重叠，鉴定出一组HAR基因，标记为HAR-脑基因，这些基因在脑部位的表达明显高于非脑部位。他们发现，HAR-脑基因在人类大脑认知功能网络的皮层扩张和皮层组织中起着至关重要的作用。最近的研究表明，皮层扩张被认为是影响ISV异质性分布的影响因素。因此，我们推测HAR-脑基因表达谱的区域变异可能是ISV在FC中异质性分布的潜在遗传基础。然而，基因表达谱如何塑造ISV在FC中的异质性分布仍在很大程度上是未知的。

FC中ISV高的区域主要位于前额叶和顶叶皮层，主要与脑血流量高的区域相重叠。静息态下的脑血流（CBF）反映了区域代谢水平，是人类大脑的一个基本生理特性。此外，静息态的CBF也受到参与神经发生和神经元发育遗传因素的影响。此外，此前的一项研究发现，影响大脑代谢的基因也调节FC。因此，我们推测脑代谢水平可能介导了基因表达对FC中ISV的影响。

为了揭示遗传因素对FC中ISV的作用机制，我们进行了一项转录-神经成像关联研究（图1）。我们的第一个目标是基于人类连接组计划（HCP；299成人被试）的高分辨率数据调查ISV的空间配置及使用基于元分析方法的探究其与各种认知能力的关系。基于之前的研究，我们假设FC中的高ISV可能位于关联皮层，这往往负责高阶功能。我们的第二个目标是通过直接检查FC中基因表达谱和ISV的重叠空间变异，通过研究从艾伦人脑图谱获得的基因表达谱与FC中被试间变异之间的关系。我们假设，对脑神经元发育至关重要的HAR-脑基因的表达与FC中的ISV显著相关。我们的第三个目的是通过中介分析来模拟基因表达谱、CBF和ISV空间分布之间的关系来检验静息态CBF的潜在中介效应。

图1.研究设计和研究方法的示意图。(A)使用来自HCP的重复测量R-fMRI数据来计算FC中ROI水平的ISV。(B)利用来自艾伦人脑图谱的大脑皮层区域的微阵列基因表达数据，获得6个供体的平均基因表达谱。©采用偏最小二乘回归方法研究ISV在FC中的分布与基因表达谱之间的关系。(D)ISV相关转录-神经成像关联的基因特异性分析。(E)对主要相关基因的基因富集分析。(F)检测FC中基因、静息态CBF和ISV之间关系的中介分析。ISV，被试间变异性，FC，功能连接，PLS，偏最小二乘，CBF，脑血流。

2. 方法
2.1 被试
被试来自人类连接组计划（HCP）数据库的900名参与者中的339名不相关的健康成年人。由于HCP提供了来自大量双胞胎和非双胞胎兄弟姐妹的数据，我们只选择了不相关的被试，每个被试都有一个独特的家庭ID，以避免由家庭结构中共享的遗传和环境因素导致的混杂效应。所有被试的年龄都在22岁至37岁之间，并提供了知情同意书。HCP得到了华盛顿大学机构审查委员会的批准。

2.2 fMRI数据获得
所有R-fMRI数据均使用定制的32通道西门子3T连接体Skyra扫描仪收集。在扫描过程中，被试被要求睁开眼睛，盯着黑色背景上明亮的十字注视点，然后放松。R-fMRI数据在两个不同时间阶段收集。每个阶段包括两次运行扫描，包括从左到右（LR）和从右到右（RL）相位编码方向，导致每个被试进行4次静息态磁共振扫描。每个R-fMRI扫描使用多波段梯度回波平面成像序列，具体参数如下：重复时间（TR）= 720 ms，回波时间（TE）= 33.1 ms，翻转角 = 52°，视野 = 208×180 mm2，矩阵大小= 104×90, 共72层，体素大小 = 2×2×2 mm3，多波段系数 = 8，共1200卷（扫描时间为14.4 min）。为了消除不同相位编码方向对我们的发现的潜在影响，我们的分析仅限于在两个不同阶段的LR相位编码运行的R-fMRI数据。

2.3 R-fMRI数据预处理
R-fMRI数据首先由HCP的最小预处理程序进行预处理，其中包括梯度失真校正、头部运动校正、图像失真校正、对蒙特利尔神经学研究所（MNI）空间的空间转换和强度归一化。40名被试因头部运动过度而被丢弃。因此，我们使用299名被试（28.46±3.69岁，139名男性/160名女性）进行后续分析。本研究的进一步数据预处理采用静息态功能磁共振数据处理助手（DPARSF）和统计参数映射软件（SPM12）。我们执行的额外预处理步骤包括：(1)去除线性趋势；(2)回归噪音信号（包括24个头部运动参数、脑脊液、白质和全脑信号）；(3)进行时间带通滤波（0.01-0.1Hz）。利用回归后的残差被用于构造FC矩阵。

2.4 FC矩阵构造
为了构建全脑FC矩阵，使用625个相似大小区域的分割图谱将脑灰质（不包括小脑)分割成625个感兴趣区域（ROI），保留了自动解剖标记（AAL）标签。然后，通过平均该区域内所有体素的时间序列，从每个ROI中提取时间序列。最后，计算每对可能的ROI的时间过程之间的皮尔逊相关系数，并使用Fisher-z变换进行归一化，得到每个被试的625×625的FC矩阵。

2.5 FC的ISV

模块水平的ISV：为了在模块水平上量化FC中的ISV，将625个ROI划分为7个功能模块，包括视觉（Vis）、躯体运动（Mot）、背侧注意（dATN）、腹侧注意（vATN）、边缘（LMB）、额顶叶（FPN）和默认模式网络（DMN）。每个ROI都被分配给与ROI重叠的体素数最多的模块。值得注意的是，皮层下区域的19个ROI没有参与模块内FC图的构建，因为它们没有与上述任何模块重叠。对于每个模块，我们首先提取模块内所有ROI对之间的FC值，以生成模块内的FC映射。然后，模块内FC模式的ISV计算方法与上述ROI级ISV相似，只是每个ROI的FC图被模块内FC图取代。因此，我们获得了一个299×7的模块级ISV矩阵，其中每个元素都是单个被试与相关模块内的其他298名被试之间的被试间变量的平均值。

为了比较不同模块之间的模块内ISV差异，进行了非参数排列检验（N=10000）。多次比较采用错误发现率（FDR）校正，显著性阈值为p < 0.05。

2.6 行为数据
为了研究FC中的区域ISV如何作为先前观察到的特定行为和认知的个体差异的机制，我们使用NeuroSynth荟萃分析来评估与区域ISV相关的行为主题分析数据库。具体来说，原始的ISV图被分成20个5%增量的间隔（即从0-5%到95-100%的间隔），然后二值化得到20个二进制映射。这20张二进制地图中的每一张都被用作元分析的输入，分析的输出是与23个行为主题相关的z统计数据，它们代表了广泛的行为（例如，运动、情感和工作记忆）。NeuroSynth荟萃分析可以为涉及不同认知功能的大脑区域的ISV组成模式的详细差异提供额外的见解。

2.7 基因表达
2.7.1 AHBA数据集
为描述ISV的遗传基础，415个脑表达HAR基因（进一步称为HAR-脑基因）首次由wei等人提出，这些脑基因的基因表达谱从艾伦人类大脑图谱数据集（AHBA）中提取完整的微阵列基因表达数据。AHBA由58,692个基因的表达谱组成，由20,700个探针测量，分别来自6名人类捐赠者的3702个空间不同的组织样本（均无神经精神或神经病理疾病史）。本研究纳入了左半球的组织样本，因为所有6个供体的数据均可用于左半球，而只有2个供体可用于右半球。每个样本的局部基因表达值都带有MNI 152空间中的X、Y、Z坐标，表示样本被提取的位置，使我们可以将表达值映射到其他脑图谱。

获得基因表达值和MNI 152坐标从AHBA每个样本之后，我们映射组织样本的AHBA基因表达值在大脑区域AAL-625地图集。首先，根据每个供体的同一基因对应的探针中的说明，对每个供体的多个探针的表达值取平均值，为每个样本生成20,700个基因表达水平。然后，将每个样本上所有基因的基因表达值除以样本的平均基因表达值进行归一化处理。第二，根据每个供体微阵列数据文件的SampleAnnot.csv中的样本注释，排除左半球外的样本。第三，我们计算了报告的样本的MNI坐标与位于AAL-625图谱左半球的所有灰质体素的MNI坐标之间的最小欧几里德距离，以找到每个样本最近的体素。每个样本被分配给一个最近的体素所属的特定ROI，并使用2 mm的距离阈值来消除不准确的ROI分配。我们通过目视检查来检查分配，以确保样本的位置与分配的ROI的位置重叠。在完成上述程序后，6个供体的组织样本在空间上被映射到302个ROI上。

通过平均映射到该特定ROI的样本的表达数据，计算每个ROI的基因表达数据。每个基因的基因表达数据被归一化为每个供体数据集中所有ROI的z分数。然后对6个供体的归一化基因表达数据进行平均，以获得302×20,700组水平的基因表达矩阵。从完整的组水平基因表达数据矩阵中提取415个HAR-脑基因的基因表达数据，得到302×415 HAR-脑基因表达矩阵。为调查是否HAR-脑基因更高表达特别是在模块高模块内ISV（例如，FPN，DMN，dATN），首先HAR-脑基因表达矩阵平均基因获得每个ROI的平均基因表达，然后平均在每个功能模块内。采用非参数排列检验（N = 10,000）来比较模块之间的平均基因表达差异，用FDR进行多重比较校正。

2.8 ISV、HAR-脑基因表达与CBF的关系
2.8.1 ISV图谱与HAR-脑基因表达谱的相关性
为了验证我们的假设，即HAR-脑基因表达可能是FC中ISV分布的遗传根源，我们使用偏最小二乘（PLS）回归来确定在FC中与ISV显著相关的HAR-脑基因的表达模式。PLS回归是一种多变量分析，旨在识别加权基因表达得分（预测变量）的线性组合，对FC中最能预测ISV（反应变量）。PLS回归已广泛应用于神经成像和转录数据分析。在这里，我们使用Whitaker等人共享的代码来进行PLS回归。

为检查是否R2系数解释了超过10%的总方差明显大于偶然实现，使用BrainSMASH软件，我们使用10000次保留空间自相关的置换检验生成PLSR2零模型回归。我们还使用了类似的空间自相关控制的置换检验来检验PLS成分与ROI水平ISV图之间的空间相关性的显著性。此外，为了确定HAR-脑基因是否比其他基因与ISV图谱更特异性相关，我们进行了两种类型的基因特异性分析。具体来说，我们从2564个脑基因（不包括HAR脑基因I型）和20285个AHBA基因（不包括HAR脑基因II型）中随机选择相同数量的HAR脑基因（即415个基因），分别重复PLS回归10000次。与其他可用的身体部位相比，我们从Wei等人的研究中获得了在脑组织中表达量明显更多的脑基因。从10000次重复中获得的ISV图之间的Spearman相关性构成了两个零模型（类型I和类型II）。此外，我们使用Bootstrap方法估计每个基因权重时的估计误差，并将每个基因的权重除以估计误差，得到校正后的权重。我们根据校正后的权重对基因进行排序，这代表了它们对PLS成分的贡献。

为识别基因可能的相关生物功能，我们相关基因与前几个重要成分中正权重基因（前10%）进行基因富集分析（GCEA）。与随机基因类别分配相比，SBP-space集成零模型利用表型的空间自相关结构，保存基因表达数据的属性（例如，类别内基因共表达和类似的空间自相关结构）和原始表型的空间自相关特征，这可能有助于建立一个更保守的空间约束零分布来减少假阳性率。具体来说，我们使用基因本体术语层次文件（数据版本2019-04-17）和相应的注释文件，从基因本体资源检查的预定义的相关基因是否富集于特定的功能解释，包括生物过程、细胞成分和分子功能。根据GCEA工具箱的管道，我们完成了基因到类别的注释，并对GO类别之间的层次关系进行了预处理，并进一步将我们的分析限制在具有10-200个基因注释的GO类别上。对于每个类别，我们使用BrainSMASH软件模拟10000个保留空间自相关的置换ISV图构成零模型测试类别级基因得分的重要性，以测量ISV图之间的平均空间相关性和多个基因表达谱的类别。在将高斯分布拟合到估计的零分布后估计p值，并通过p < 0.05的FDR对GO类别的p值进行校正，报告FDRp值低于0.05的GO类别。

2.8.2 ISV图与CBF图之间的相关性
为了探究ISV的空间分布是否能反映CBF的构型，我们比较了ISV图与静息状态下CBF图的空间分布，其显示了脑区的代谢成本。具体来说，根据每个ROI内体素的MNI坐标，从CBF图中提取相应坐标的血流值，并取平均值，得到基于AAL-625图谱的ROI水平的CBF图。值得注意的是，我们删除了12个ROI，因为其在该ROI中超过90%的体素的血流值为零。然后，我们计算ROI水平ISV图与CBF图之间的空间相关性，并进行保留空间自相关的置换检验来检验空间相关性的显著性。

2.8.3 中介分析
为了检验CBF分布是否介导了基因表达对ISV图的假设，我们使用SPSS Process宏中的简单中介模型（模型4）进行了基于Bootstrap中介分析。使用5000次Bootstrap进行中介分析，以生成偏差校正置信区间（CI）。当95% CI不包括零时，间接效应被认为是显著的。

3. 结果
3.1 FC中ISV在不同脑区和内在模块中的空间分布
我们观察到ISV在FC中的空间分布是区域异质性的（图2A）。联合皮质，包括前额叶（背外侧额上回、额中回、额下回）、颞叶（颞中回、颞上回）和顶叶（边缘上回），表现出较高的ISV。同时，单模态皮层(包括初级视觉区（楔形回、舌回、枕上回）、感觉运动区（中央后回、中央前回）、皮层下区域（苍白球、尾状核、丘脑、杏仁核）均表现为低ISV。这种模式与之前对FC个体变异的观察结果相一致。
对于模块级的ISV，目视检查显示，FPN和dATN等高阶认知模块的变异性最高，而LMB和Vis和Mot的变异性最低（图2B）置换检验结果显示，4个高阶认知模块（FPN、dATN、DMN、vATN）的ISV显著高于LMB和初级模块（Vis、Mot）的ISV（ps < 0.035, 10,000次置换检验，FDR校正）。此外，vATN的ISV显著低于FPN和dATN（ps < 0.024, 10,000次置换检验，FDR校正）。

3.2 ISV的空间分布反映了从初级功能到高阶功能的认知谱
通过重叠20个二进制ISV图与23个NeuroSynth数据库中的行为主题地图，我们发现ISV较低的区域更相关的主要功能为，“运动”、“多感觉处理”，和“听觉处理”，和ISV较高区域与高阶认知功能更相关，如“语言”、“认知控制”、“工作记忆”、“数字认知”和“抑制”（图2C）。从下到上排列的主题的行为对应于图2B中模块的功能，根据模块级的ISV进行排序。

图2.FC中ISV的空间分布图及NeuroSynth荟萃分析结果。(A)ROI级ISV的空间分布。图2和图3所示的皮层下区域包括脑岛叶、尾状核、壳核、苍白球、丘脑、海马和杏仁核。(B)模块级ISV的比较。误差条表示每个模块下所有被试的模块级ISV的标准偏差（SD）。右边的矩阵显示了模块之间模块级的ISV差异（行列）；在置换检验中不显著的模块级ISV差异（p > 0.05）被设置为零。© NeuroSynth荟萃分析结果。

3.3 HAR-脑基因在脑区和模块的表达谱
为了研究ISV的空间分布与415个HAR-脑基因的相关表达，我们将AHBA数据集中的样本映射到ROI中，并估计了每个ROI中415个HAR-脑基因的平均表达量。HAR-脑基因在额叶皮质（内侧额上回、眶额上回、背外侧额上回）、颞极（颞上回、颞中回）、前扣带回和副扣带回等区域均有高水平表达。同时，视觉皮质（梭状回、舌回）和皮层下区域(丘脑、苍白球、海马旁回、尾状核、壳核）表现出低水平的基因表达（图3A）。因此，从皮层下区域和初级区域到联合皮层，HAR-脑基因的平均表达有增加的总体趋势。
置换检验显示，HAR-脑基因在LMB、DMN、dATN、vATN和FPN中的表达水平显著高于Vis（ps < 0.024, 10000次置换检验，FDR校正），但5个模块之间无显著差异。此外，DMN中的基因表达量显著高于Mot（p = 0.024, 10000次置换检验，FDR校正）（图3B）。

3.4 基因表达与ISV的空间分布有关
使用PLS回归，我们发现两个显著成分解释了ISV中31.29%的方差（p < 0.001，10000次置换检验，FDR校正)。具体来说，第一个偏最小二乘成分（PLS1）代表显著的ISV和基因表达的正相关，主要反映在前额叶、顶叶和外侧颞区域（Spearman

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