植物组织培养过程中的常见难点及解决

玻璃苗、褐化和污染是组培的3大难点。下面小编与您分享一下常见的处理方法。

玻璃化现象

在进植物组织培养时，经常会发现试管苗呈半透明状，植株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩或卷曲、脆弱破碎；叶表无角质层蜡质，没有功能性气孔，仅有海绵组织，没有栅栏组织。这种试管苗生长异常现象被称为“玻璃化”，是植物组织培养中特有的一种生理性病变，是培养环境中的一些物理、化学和生化因子共同作用使植物组织新陈代谢紊乱所造成的。玻璃苗的光合能和酶活性低，器官功能不全，分化能力低，很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料。

1.1 玻璃苗发生的因素

培养材料种类和外植体类型影响玻璃苗的发生：梅菜外植体玻璃苗发生率依次是下胚轴≥茎尖≥子叶。瑞香基部茎段玻璃苗的发生率最低，其次是茎尖，中部茎段产生的玻璃苗几率最高。此外，玻璃化还可能与外植体大小有关。组培苗生长的微环境能够影响玻璃化的发生有研究表明，光照时间太长会导致玻璃化现象的增加，超过１４ｈ玻璃化现象较严重。使用透气性较差的塑口薄膜封口或组培温度过高时，由于引起组培瓶内气体组成的改变，也提高了玻璃化率。

培养基成分（如大量元素、植物激素和蔗糖浓度等）与玻璃化现象有关：培养基中的ＮＨ４＋过多容易导致试管苗玻璃化的发生。在ＢＡ质量浓度０、５～１．０ｍｇ／Ｌ条件下，玻璃苗率随ＢＡ浓度的增加而显著上升。蔗糖浓度与玻璃化呈负相关，在一定范围内，蔗糖浓度越高，玻璃苗的比率越低。

1.2 措施：

①增加组培室内通气，并改善培养容器的通风换气条件，适当缩短继代间隔时间。许多研究表明，使用透气性好的容器或封口材（如牛皮纸和棉塞）可显著降低玻璃苗率。

增加自然光照

②组培室温度：组培室温度控制在２０～２５ ℃，可缓解玻璃化现象。另外，采用昼夜变温交替取代恒温也是错的选择。　

③适当提高培养基中蔗糖含在培养基中添加４％和３.５％的蔗糖，能分别较好地预防光叶楮和山桐子组培玻璃苗的发生。　

④调节培养基中植物生长调节剂的浓度和比例　

褐变

2.1 影响褐变的因素

植物种类、基因型及外植体类型：橡胶树不同品种或品系的褐变程度不同，海垦２号的花药褐变较少，而有些品种极褐变。除了木本植物，豆科植物和芸苔属植物原生质体培养中也普遍存在着褐化问题。甜菜品系的染色体倍数性、无菌苗的苗龄、外植体部位等因素对甜菜组织培养过程中外植体褐变均有影响。在辣椒的组织培养中，下胚轴分生能较强，其外植体生长旺盛，褐变程度低于子叶。

培养条件光照过强或光照时间超过１６ｈ的外植体很快褐变¨。温度过高也能促进培养物的褐变。ＣＯ浓度过高引发细胞内积累过多的ＣＯ；并与细胞膜上ｃａ结合而使有效ｃａ减少，导致内膜系统紊乱和瓦解，致使褐变发生。培养基ｐＨ值适宜也是某些植物种类产生褐变的原因之一。

培养基成分对一般桉树来说，大元素和外源激素的浓度增大会造成褐化程度的加重。激素使用不当时，外植体也容易褐变。ＮＡＡ浓度超过０．２ｍｇ／Ｌ时，褐变率明显增高。

外植体消毒一般消毒时间越长，褐化率越高。

2.2 克服褐变的方法：

选择适当的外植体处于旺盛时期的外植体，具有较强的分裂能，其褐变程度低。因此，最好选用实生幼苗和早春的材作为外植体。取材时，还应根据植物种类选择适宜的基因型和部位。

进行材料的预处理：外植体经流水冲洗后，放在２～５℃的低温下处理１２～２４ｈ，再用升汞或７０％酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养５～７ｄ，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用０、１％漂白粉溶液浸泡１０ｍｉｎ，再接种到合适的培养基中，如果仍有酚类物质渗出，接种后１～２ｄ立即转移到新鲜培养基中或同一瓶培养基的同部位，这样连续转移５～６次可基本解决外植体的褐变问题。

选择适宜的培养基和培养条件调节光照和温度、改善通风、调节培养基的ｐＨ值，均能够缓解外植体褐变。使用静态培养和固体培养交替进，使外植体在液体培养基上将伤口愈合后，再转至固体培养基上培养，也能减轻褐变。

添加合适的褐变抑制剂和吸附剂比较有效的褐变抑制剂有水解乳蛋白（ＬＨ）、乙二胺四乙酸（ＥＤ—ＴＡ）、血清白蛋白、柠檬酸和硫代硫酸钠（ＮａＳＯ）等。常用的吸附剂有聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）和活性炭，但使用时应注意选择适宜的浓度，否则培养基中的营养成分也会被吸附。

污染

3.1 污染原因

造成污染的原因很多，如工作环境空气不清洁，超净工作台过滤装置失效，培养基及器皿灭菌彻底，外植体带菌及操作违规等。造成污染的病原主要为细菌真菌和内源菌。细菌性污染的主要症状是培养材附近出现粘液状和发酵泡沫状物体，或在材附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹。细菌性污染除外植体带菌或培养基灭菌彻底外，主要是操作人员的慎造成的。真菌污染表现在培养基上产生灰褐色、暗绿色或白色等菌，严重时可导致组培苗出现病状，甚至导致苗腐烂、死亡。真菌污染除直接接触传播外，主要通过空气媒介传播。对外植体带菌引起的污染，情况则比较复杂，与外植体的种类、取材季节、部位、预处方法及消毒方法等密切相关。

3.2 污染防治

①保持组织培养室和接种室的洁净。操作人员应定期用８４灭菌和酒精喷雾。注意除尘，定时用紫外灯消毒。

END

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