一、高效液相色谱图中峰高、峰面积、峰面积比都是代表什么呢？

高效液相色谱图中峰面积、峰面积比都是代表什么呢？ 分析测试百科网wiki版

峰高指待测组分从柱后洗脱出最大浓度时检测器输出的信号值，单位一般为mAU，AU或mV，也可代表相对含量，但不如峰面积准确。

峰面积指峰高与保留时间的积分值，单位一般相应为mAU*min，AU*min或mV*min，代表相对含量比较准确。

峰面积比代表各物质的相对百分含量，单位一般为%。

峰高和峰面积的选择

在色谱定量分析中，选用峰高法还是选用峰面积法，主要决定在检测器的线性范围内，峰高和峰面积测量的准确性和重复性。除了归一化法最好用峰面积法外，其他三种定量方法中峰高和峰面积都可用作精确的定量方法。

在检测器的线性范围内，峰高和峰面积测量的准确性受色谱分离度的影响，要准确地测量峰高和峰面积，色谱分离应达到一定的分离度才行。

于世林老师编著的《高校液相色谱方法及应用》

二、高效液相色谱法怎么分析谱图?

分析峰的个数，位置，峰高，峰面积

作者：秋硕
链接：https://www.zhihu.com/question/359904536/answer/1782634211
来源：知乎
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色谱图其实简单地讲是一个横坐标是时间；纵坐标是电信号的二维图谱。

高效液相色谱法，你可以简单地想象，固定相是一个多空海绵状的柱形结构，样品在孔洞中进进出出。因为各个物质的吸附能力不同，所以才会在色谱图中拉开距离。

实验相关的参数：

保留时间是溶质通过色谱柱所需的时间。这种特性可以在一种混合物的几个组分之间共享，这就是为什么应用MS方法的原因。由此产生的色谱图显示保留时间与强度(存在的组分量)的关系。

1、保留时间：也就是可以定性的数据参数

保留时间是溶质通过色谱柱所需的时间。这种特性可以在一种混合物的几个组分之间共享，这就是为什么应用MS方法的原因。由此产生的色谱图显示保留时间与强度(存在的组分量)的关系。

如果使用同样的色谱柱，同样的流动相，分析同样的样品，那么这个样品的保留时间，应该是固定的。不同保留时间的色谱峰，应该表现出的是不同的物质。如果你跑的是反相色谱，那么色谱峰越靠后，它对应物质的极性也就越小。

2、峰面积：也就是可以定量的数据参数

峰值检测在滤波之后进行，其中峰值表示成分或成分的断裂。峰可以根据它们覆盖的高度或面积来选择。通过将存在的峰与已知的峰进行匹配，可以通过眼睛识别某些峰模式。这可以帮助确定存在什么分子，或者分子中存在多少原子。

色谱图中可以读出来的参数，在同一个色谱条件下，同一个物质的浓度和峰面积是成正比的。也就是说，如果你配制1.0mg/ml的X物质，进样后峰面积是10000，那么，你配制0.5mg/ml的X物质，进样后峰面积差不多就是5000

3、波长:这个是可以顺利进行试验的前提条件

同一样品，同一方法，同一色谱柱，在不同波长的峰面积是不同的。一个物质指在某些特殊波长下有吸收。比如一个物质在210nm和254nm处有吸收。那么波长在280nm处可能无法检出该物质。所以一个实验方法开始时要进行波长扫描。

答：分析方法其实有个入门级别的。

1，首先区分溶剂峰跟产物峰。在区分这两个之前，你要知道一件事情。我们都是用高极性溶剂来溶解待测产物的（我用的是DMSO溶解的产物，它的极性在常用溶剂里面排第四），所以如果你用的仪器如果不是正相色谱仪，5分钟内必定会出一个溶剂峰。除了这个溶剂峰以外，后面的就都是特征产物。做到了这一步你就成功了一半。

2，然后就是根据峰值数量的多少来判断产物多样性。主要是数哪些非常尖锐的峰，然后比大小。

3，最后就是各种产物的含量配比，比较峰高就行了。

4，高效液相色谱图的目的就是在于探究待测物中产物多样性以及含量配比情况。

链接：https://www.zhihu.com/question/359904536/answer/1932677473

峰面积_百度百科

峰面积比是指在色谱图，背景线以上部分的总面积，表示待测物的含量，面积越大，含量越高。

目录

  1. 1 内标法
  2. 2 外标法
  3. 3 峰高和峰面积的选择

内标法

内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校准和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。 内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化合物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化合物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。

外标法

外标法external standard method 色谱分析中的一种定量方法，它不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性 [1]  。

峰高和峰面积的选择

在色谱定量分析中，选用峰高法还是选用峰面积法，主要决定在检测器的线性范围内，峰高和峰面积测量的准确性和重复性。除了归一化法最好用峰面积法外，其他三种定量方法中峰高和峰面积都可用作精确的定量方法。

在检测器的线性范围内，峰高和峰面积测量的准确性受色谱分离度的影响，要准确地测量峰高和峰面积，色谱分离应达到一定的分离度才行。图2-3-18 至图2-3-22给出了峰高比1:1至16:1 时的标准分离度曲线，每张图上的黑点表示了每个峰峰尖的真实位置，此黑点与图中所示的峰尖的垂直位移就是测量误差。峰高比越大，要求能准确测量峰高的分离度也越大。峰高比为1/1和2/1时，峰高能得到准确测量的最低分离度为0.8；峰高比为4/1 时，峰高能得到准确测量的最低分离度为1.0；峰高比16/1 时，峰高能得到准确测量的最低分离度为1.25。关于分离度对峰高测定准确度的影响大致可认为：当分离度Rs-1.0 时，相对峰高从128:1 变化到1:128时，峰高的测量误差小于+-3%。

在分离度较好，色谱峰形较好，峰面积可以准确测量时，以用峰面积法定量为好。特别是在气相色谱使用程序升温和液相色谱使用多元梯度洗脱时，最好使用峰面积法定量。但当分离度不好，色谱峰形不好（如严重拖尾）时，峰面积测量引起的误差较大，此时使用峰高法定量较好。保留时间短的色谱峰峰形较尖（峰尾宽较小），此时峰高测定较峰面积测定准确，宜用峰高法定量；而保留时间长的色谱峰峰形较宽（峰尾宽较大），此时峰面积测定较峰高测定准确，宜用峰面积法定量 [2]  。

三、怎么看懂液相色谱图（液相色谱仪图解）

怎么看懂液相色谱图（液相色谱仪图解）_环球信息网

对于每一个身经百柱的实验人员来说，液相色谱图是他们打开未知物质世界的大门，科研中的很多问题都能从色谱图中得到很好的反映，有些问题可以通过改变设备参数得到解决，而有些问题则必须通过修改操作程序来解决，毕竟，正确选择色谱柱和流动相才是得到好的色谱图的关键。

狮妹在此根据大家实践中可能会经常遇到的一些图谱问题进行了整理汇总，大家一起来看一下吧。

01 拖尾峰

1、筛板阻塞：柱子两头的过滤筛板如果堵塞，样品就会在筛板部分受阻而形成时间延迟，使得样品在柱后流出时峰型形成拖尾。需要通过反冲色谱柱，或者更换筛板。

2、色谱柱塌陷：是指色谱柱由于其它原因引起了柱效率丧失，不能对物质形成保留，使得物质不在固定相上保留而随流动相流出，但是又还有一点柱效，因此形成拖尾。需要重新填充色谱柱或者更换色谱柱。

3、有污染：即样品不在同一起跑线起跑，从后面开始跑得到达终点稍晚，表现出拖尾。更换色谱柱或者采用有机溶剂梯度洗脱1h以上，以冲洗柱子。

4、流动相PH值选择错误：如某PH下有的样品存在分子型和离子型的动态平衡，离子型的陆续向分子型转化就会表现出拖尾。调节PH值可抑制分子解离，改善拖尾，对于碱性化合物，相对较低的PH值更有利于得到对称峰。

02 前沿峰

1、样品过载：被保留的样品在正常出峰时间前陆续出来，形成前沿峰。降低样品含量。

2、样品溶剂选择不恰当：当样品溶剂的洗脱能力大大强于流动相时会出现前沿峰，例如，在反相色谱中用已腈做样品溶剂，而流动相的洗脱力较弱时会出现前沿峰。选择流动相或者接近流动相的比例作为样品溶剂。

3、色谱柱损坏：色谱柱柱效损失，不能对物质形成保留。更换色谱柱。

4、在大峰前有小峰出现，假象前沿峰，即大峰前包埋了没有分开的小峰。调整流动相洗脱梯度。

03 倒峰

1、样品折射率小：示差折光检测器测的信号是折射率，出现倒峰的原因是组分的折射率小于流动相。

2、密度的原因：密度不一样，出来的峰正倒不一样。

3、进样所致：进样时，样品对原有流动相产生瞬间阻断，然后瞬间涌流，所以产生先倒后高的“溶剂峰”。

4、基本不可避免：试着使用与流动相相同的溶剂作为溶样溶剂，另外进样之前注意平衡跟冲洗参比池。倒峰基本上不能避免，但是这样操作会小些。

04 包裹

1、色谱柱问题：色谱柱流失，柱子被污染。

2、样品溶解度差：温度可能会影响到溶解度。

3、流动相不均匀：一般是流动相没配好，管路流动相不均匀，也会导致上述现象。

05 基线漂移

1、柱温波动：即使是很小的温度变化都会引起基线的波动，通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。使用柱温箱，控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器。

2、流动相不均匀：流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。使用HPLC级的溶剂，流动相在使用前进行脱气处理。

3、流通池被污染或有气体：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸(不要用盐酸)。

4、流动相配比不当或流速变化：更改配比或流速，为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。

5、样品中有强保留的物质：以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。

06 出现宽峰

1、色谱柱污染或失效，造成塔板数降低：更换同样类型的色谱柱，如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。

2、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大：更换内径较小的短管路。

3、检测器对反应时间或池体积响应过大：减少响应时间或使用更小的流通池。

07 基线噪音

1、在流动相、检测器或泵中有空气(尖锐峰)：流动相脱气，冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。

2、漏液：检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。

3、流动相混合不完全：用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂。

4、温度影响(柱温过高，检测器未加热)：使用柱温箱，减少温度差异或加上热交换器。

5、在同一条线上有其他电子设备(偶然噪声)：断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。采用精密级稳压电源。

08 分离度不够

1、流动相梯度洗脱设置不合理：优化梯度洗脱程序。

2、流动相污染或变质(引起保留时间变化)：重新配置流动相。

3、保护柱或分析柱阻塞：去掉保护柱进行分析，如果必要则更换保护柱；如果分析柱阻塞，可进行反冲；如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序；如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。

四、HPLC故障排除指南-如何识别、找出和纠正最常见的HPLC问题

HPLC故障排除指南

找出HPLC问题

在HPLC系统中，引起问题的来源很多。首先界定问题，然后从源头上杜绝问题。

使用表1确定是哪个或哪些组件造成的问题。通过排除法，通常可以帮助您查明具体原因并纠正问题。

如何防止流动相问题

色谱图灵敏度低，基线上升、噪音、尖峰等通常因流动相所致。在梯度洗脱中，流动相中的污染物特别麻烦。它们可能会使基线上升，随着受污染的组分增加，可能出现伪峰。

。。。

为防止系统中出现气泡，对流动相溶液脱气。通常首选在线脱气机，但如果流动相不含任何挥发性成分，则可以选择使用喷氦脱气。

隔离泵问题

泵必须在各种条件下向色谱柱提供恒定的溶剂流量。现代HPLC泵采用单活塞或双活塞、注射器或隔膜泵设计。

泵系统问题通常易于发现和纠正。一些较常见的问题包括色谱图中保留时间不稳定，基线噪音或尖峰。泵配件或密封件泄漏会导致色谱分析不良。泄漏的确切迹象是在泵连接处有盐析出。应每天用新鲜的去离子水 从系统中冲洗缓冲盐。

进样器和进样溶剂

进样器可快速地将样品导入系统，对溶剂流的干扰最小。HPLC系统目前采用可变环、固定环和针式进样器。进样器有手动、气动或电动驱动选择。

进样器的机械问题（例如，漏液、毛细管管线堵塞、密封件磨损）易于发现和纠正。使用柱前过滤器可防止因进样器密封件的物理老化而导致的色谱柱筛板堵塞。不可再现进样等其他问题，则较难解决。

定量环未完全填充、进样溶剂与流动相不相容或样品溶解度差，均可能导致峰高易变、裂峰和宽峰。尽可能在流动相中溶解和注入样品。否则，应确保进样溶剂的洗脱强度低于流动相（表3）。请注意，某些自动进样器使用单独的针筒清洗液。确保清洗液与流动相兼容且比流动相弱。在反相和正相分析之间切换时，这一点尤为重要。

色谱柱保护

虽然流动相入口过滤器、进样前过滤器、柱前过滤器、以及保护柱不属于大多数设备的必备部件，但它们大大减少了与复杂分离相关的问题。我们建议让所有样品经过0.45 μm或0.2 μm针筒过滤器过滤。我们强烈建议使用保护柱。

过滤器和保护柱可防止颗粒和强保留化合物积聚在分析柱上。这些一次性产品的使用寿命取决于流动相成分、样品纯度、pH值等。当这些装置被颗粒污染或堵塞时，压力增加，峰值变宽或分裂。例如，图B给出了使用保护柱的示例。

图 B.Supelguard柱延长分析柱的寿命

充分发挥分析柱性能

无论色谱柱是否包含键合的反相或正相、离子交换、亲和性、疏水性相互作用、分子筛或树脂/硅基填料，与分析柱相关的最常见问题是劣化。劣化的迹象包括峰形差、裂峰、肩峰、解析度降低、保留时间减少和背压高。这些迹象表明污染物积聚在筛板或色谱柱入口处，或者填料层中存在空洞、沟槽或凹陷。

在高效柱中，劣化更明显。例如，与由2微米或更大筛板截留的5微米或10微米填料相比，由0.5微米筛板截留的3微米填料更容易堵塞。适当的色谱柱保护和样品制备对于发挥色谱柱的最大功效至关重要。

过载色谱柱会导致峰形差和其他问题。

色谱柱典型容量

色谱柱容量取决于多种因素，但色谱柱上分析物总量的典型值如下：

色谱柱类型 色谱柱尺寸 色谱柱容量
分析柱 25 cm x 4.6 mm <500 μg
半制备柱 25 cm x 10 mm <100 mg
制备柱 25 cm x 21.mm <500 mg

解决检测器问题

检测器问题分为两类——电气和机械/光学问题。如有电气问题，请联系仪器制造商。机械或光学问题通常因流动池所致。与检测器相关的问题包括漏液、气泡和流通池污染。这些通常会引起色谱图出现尖峰或基线噪音或低灵敏度。

某些流通池，尤其是用于折射率检测器的流通池，对压力敏感。超过制造商建议的流速或背压将破坏流通池窗。旧灯或坏灯以及不正确的检测器上升时间、增益或衰减将降低灵敏度和峰高。电缆连接错误或反接也可能是导致问题的根源。

色谱柱恒温箱、记录器

这些组件很少会导致系统出现问题。我们将在故障排除表（表1）中详细讨论这点。

保留准确的记录

大多数问题不会一夜之间发生，而是有个发展的过程。准确地保存记录对于发现和解决许多问题来说至关重要。

评估您所收到的每个色谱柱，并在日后进行定期评估。通过保存色谱柱柱效、所使用的流动相、灯电流、泵性能等的书面记录，您可以监控系统的性能。

记录还有助于防止错误，例如将水导入硅胶柱，或因添加过多的有机溶剂而使系统中的缓冲液发生沉淀。许多分析员会对HPLC系统做一些修改。可靠的记录是确保修改不会导致问题的最佳方法。与泵、检测器、自动进样器和数据系统相关的问题，请参阅仪器手册的故障排除指南。

HPLC问题索引

问题 问题编号
基线漂移 12
噪音，不规则 14
噪音，规则 13
色谱柱背压
高于正常值 4
低于正常值 3
鬼峰 19
异常峰形，不正确
宽峰 15
前伸峰 10
圆弧形峰 11
裂峰 7
峰拖尾 8
峰拖尾，初次和后期进样时 9
峰
高度变化 16
峰丢失 2
负峰 18
无峰 1
不可分辨峰 6
保留时间，不定 5
选择性改变 17

表1.HPLC问题，可能原因和纠正措施

问题1：无峰/峰非常小

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 检测器灯熄灭。
  2. 检测器和积分仪或记录器之间的导线松动 / 断裂。
  3. 无流动相流。
  4. 无样品 / 样品劣化 / 样品有误。
  5. 检测器或记录器设置过高。
  1. 开灯。
  2. 检查电气连接和电缆。
  3. 参见“无液流”（问题2）。
  4. 确保自动进样器样品瓶中有充足的液体且样品中没有气泡。采用新标样评估系统性能，以确认样品是否为问题的根源。
  5. 检查衰减或增益设置。检查灯泡状况。必要时自动归零。

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问题2：无液流

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 泵关闭。
  2. 流动中断 / 阻塞。
  3. 漏液。
  4. 泵头有空气。（压力波动说明这点。）
  1. 启动泵。
  2. 检查储液罐中的流动相液位。检查整个系统的液流。检查定量环是否有阻塞或气塞。确保流动相组分可混溶，流动相适当脱气。
  3. 检查系统是否有松动的配件。检查泵是否有漏液、是否有盐析出和异常噪音。必要时更换泵密封件。
  4. 断开保护柱（如果有）或分析柱入口处的管线。检查液流。以高流速（例如5-10 mL/min）冲洗泵，如有必要，预湿润系统。（分别预湿润每个泵头。）如果系统有单向阀，则松开阀门，让空气逸出。如果问题仍然存在，则用100％甲醇或异丙醇冲洗系统。如果还未能解决问题，则应联络系统制造商。

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问题3：无压力 / 压力过低

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 漏液。
  2. 流动相液流中断/阻塞。
  3. 泵头有空气。（压力波动说明这点。）
  4. 色谱柱入口端接头泄漏。
  5. 系统其他地方有空气。
  6. 泵密封件磨损导致泵头周围泄漏。
  7. 单向阀故障。
  8. 泵密封不良。
  1. 检查系统是否有松动的配件。检查泵是否有漏液、是否有盐析出和异常噪音。必要时更换泵密封件。
  2. 检查储液罐中的流动相液位。检查整个系统的液流。检查定量环是否有阻塞或气塞。确保流动相组分可混溶，流动相适当脱气。
  3. 断开保护柱（如果有）或分析柱入口处的管线。检查液流。以高流速（例如10 mL/min）冲洗泵，如有必要，预湿润系统。（分别预湿润每个泵头。）如果系统有单向阀，则松开阀门，让空气逸出。
  4. 以两倍的流速重新接通色谱柱和泵溶剂。如果压力仍然很低，则应检查入口接头或柱端接头是否有泄漏。
  5. 断开保护柱和分析柱，并冲洗系统。重新连接色谱柱。如果问题仍然存在，则用100％甲醇或异丙醇冲洗系统。
  6. 更换密封件。如果问题仍然存在，则更换活塞和密封件。
  7. 重新装配或更换阀门。
  8. 更换密封件。

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问题4：压力过高

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 泵、进样器、在线过滤器或管线存在问题。
  2. 保护柱或分析柱堵塞。
  1. 从系统中取出保护柱和分析柱。改用活接头和0.010''内径（I.D.）或更粗的管线将进样器重新连接到检测器。以2-5 mL/min的速度运行泵。如果压力极小，则请参见原因2。如果不是，则系统地排除系统组件找出原因，从检测器开始，然后检查在线过滤器，再检查泵。更换泵过滤器（如果有）。
  2. 取下保护柱（如果有）并检查压力。必要时更换保护柱。如果分析柱阻塞，则在与检测器断开连接情况下反洗色谱柱。如果问题仍然存在，则色谱柱可能被强保留污染物堵塞。建议使用适当的再生程序（表2）。如果问题仍然存在，则更换入口处的筛板或更换色谱柱。

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问题5：保留时间不定

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 漏液。
  2. 流动相成分发生变化。（小变化亦可能导致保留时间发生较大的变化。）
  3. 泵中有空气。（保留时间随机增加和减少。）
  4. 柱温波动（在离子交换系统中尤为明显）。
  5. 色谱柱过载。（注射在柱上的溶质质量超过柱容量时，保留时间通常会减少。）
  6. 样品溶剂与流动相不相容。
  7. 色谱柱问题。（并非保留时间不稳定的常见原因。随着色谱柱老化，保留时间逐渐减少。）
  1. 检查系统是否有松动的配件。检查泵是否有漏液、是否有盐析出和异常噪音。必要时更换泵密封件。
  2. 检查流动相的组成。如果流动相是按照比例值机器混合的，则手动混合并从一个储液罐供应。
  3. 排出泵头或单向阀的空气。必要时更换泵密封件。确保流动相脱气。
  4. 使用可靠的柱温箱。 （注意：较高的色谱柱温度可提高色谱柱效率。为获得最佳结果，洗脱液应先加热再导入色谱柱。）
  5. 注入较小的体积（例如10 μL，而不是 100 μL）或在1:10或1:100稀释样品后注入相同的体积。
  6. 调节溶剂。尽可能在流动相中注入样品。
  7. 替换为相同类型的新柱，以确认是否因色谱柱的原因。如果再生程序失败，则丢弃旧的色谱柱。

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问题6：解析度降低

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 流动相污染或变质（引起保留时间和/或选择性变化）。
  2. 保护柱或分析柱阻塞。
  1. 制备新鲜的流动相。
  2. 取下保护柱（如果有）进行分析。必要时更换保护柱。如果分析柱阻塞，可反洗。如果问题仍然存在，则色谱柱可能被强保留污染物堵塞。建议使用适当的再生程序（表2）。如果问题仍然存在，则更换入口处的筛板或更换色谱柱。

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问题7：裂峰

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 保护柱或分析柱入口污染。
  2. 筛板部分堵塞。
  3. 色谱柱入口处有小（不规则）空洞。
  4. 样品溶剂与流动相不相容。
  1. 取下保护柱（如果有）进行分析。必要时更换保护柱。如果分析柱阻塞，可反洗。如果问题仍然存在，则色谱柱可能被强保留污染物堵塞。建议使用适当的再生程序（表2）。如果问题仍然存在，则入口处的筛板可能（部分）堵塞。更换筛板或更换色谱柱。
  2. 更换筛板（见上文）。
  3. 用具有相同键合相功能的薄壳型颗粒重新填充色谱柱顶部。继续沿反向流动方向使用色谱柱。
  4. 调节溶剂。尽可能在流动相中注入样品。

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问题8：初次和后期进样时出现峰拖尾

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 样品与活性位点发生反应。
  2. 流动相pH值错误。
  3. 色谱柱类型错误。
  4. 色谱柱入口处有小（不规则）空洞。
  5. 进样溶剂错误。
  1. 首先用色谱柱测试混标检查色谱柱性能。如果测试混标的检查结果良好，则添加离子对试剂或类似的碱或酸改性剂。
  2. 调节pH值。对于碱性化合物，低pH值更有利于得到对称峰。
  3. 试用其他色谱柱类型（例如碱性化合物去活色谱柱）。
  4. 详见裂峰部分。
  5. 当样品注入比流动相更强的溶剂时，会出现峰拖尾。将样品溶解于流动相中。

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问题9：峰拖尾

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 保护柱或分析柱污染 / 失效。
  2. 流动相污染 / 变质。
  3. 样品中有干扰组分。
  1. 取下保护柱（如果有）进行分析。必要时更换保护柱。如果问题源于分析柱，则运用适当的再生程序（表2）。如果问题仍然存在，则更换色谱柱。
  2. 检查流动相的组成。
  3. 用标样检查色谱柱性能。

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问题10：前伸峰

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 色谱柱过载。
  2. 样品溶剂与流动相不相容。
  3. 在主峰之前出现肩峰或基线逐渐上升可能是因为存在其他样品成分造成。
  1. 注入较小的体积（例如10 μL，而不是 100 μL）。在质量过载的情况下，以1:10或1:100的比例稀释样品。
  2. 调节溶剂。尽可能在流动相中注入样品。用50倍柱体积的HPLC级乙酸乙酯以2-3倍标准流速冲洗极性键合相柱，然后在分析前用中等极性溶剂冲洗。
  3. 提高效率或改变系统选择性以提高解析度。如有必要，尝试其他色谱柱类型（例如从非极性C18更换为极性氰基相）。

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问题11：圆弧形峰

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 检测器在线性动态范围外工作。
  2. 记录器增益设置太低。
  3. 色谱柱过载。
  4. 样品与色谱柱发生反应。
  5. 检测器和 / 或记录器时间常数设置太高。
  1. 降低样品量和 / 或降低浓度。
  2. 调节增益。
  3. 注入较小的体积（例如10 μL，而不是 100μL）或以1:10或1:100的比例稀释样品。
  4. 改变缓冲液强度、pH值或流动相组分。如有必要，提高色谱柱温度或改变色谱柱类型。 （溶质结构分析可能有助于预测相互反应。）
  5. 将设置降至最低值或不再产生进一步改善的值。

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问题12：基线漂移

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 柱温波动。（即使很小的温度变化都会引起基线波动。通常会影响折光率和电导率检测器、高灵敏度的UV检测器或间接光度模式。）
  2. 流动相不均匀。（通常漂移到更高的吸光度，而不是温度波动的循环模式。）
  3. 检测器流通池中有污染物或气体积聚。
  4. 检测器出口管路阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生基线噪音。）
  5. 流动相混合问题或流速变化。
  6. 柱平衡慢，特别是流动相发生变化时。
  7. 流动相污染、变质或未由优质化学品制备。
  8. 样品中的强保留物质（高K’值）可以极宽峰洗脱，表现出逐步升高的基线。（梯度分析会使问题加剧。）
  9. 检测器（UV）未设置在最大吸光度处，而是设置在曲线斜坡处。
  1. 控制色谱柱和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器。
  2. 使用HPLC级的溶剂、高纯度盐和添加剂。在使用前进行流动相脱气，在使用过程中喷氦气。
  3. 用甲醇或其他强溶剂冲洗流通池。如果必要，可以用1N HNO3清洁流通池（切勿使用HCl，切勿对PEEK管或配件使用硝酸）。
  4. 拔下或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。
  5. 更正组分 / 流速。为避免这个问题，可定期检查流动相组分及流速。
  6. 用中等强度的溶剂冲洗色谱柱，在分析前用10-20倍柱体积的新流动相对冲洗色谱柱。
  7. 检查流动相的组成。
  8. 使用保护柱。如有必要，在两次进样之间，或在分析过程中定期，用强溶剂冲洗色谱柱。
  9. 将波长调整至最大UV吸光度处。

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问题13：噪音（规则）

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 在流动相、检测器流通池或泵中有空气。
  2. 泵脉动。
  3. 流动相混合不均匀。
  4. 温度影响（柱温过高，检测器未加热）。
  5. 在同一条管路上有其他电子设备。
  6. 漏液。
  1. 流动相脱气。冲刷系统以除去检测器流通池或泵中的空气。
  2. 在系统中加入脉冲阻尼器。
  3. 手动混合流动相或使用低粘度的溶剂。
  4. 降低电压（differential）或加上热交换器。
  5. 断开LC、检测器和记录器，检查问题是否来自于外部。在必要时加以更正。
  6. 检查系统是否有松动的配件。检查泵是否有漏液、是否有盐析出和异常噪音。必要时更换泵密封件。

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问题14：噪音（不规则）

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议
  1. 漏液。
  2. 流动相污染、变质或由低质材料配成。
  3. 检测器 / 记录器电子元件的问题。
  4. 系统内有气泡。
  5. 检测器内有气泡。
  6. 流通池污染。（即使是极少的污染物也会产生噪音。）
  7. 检测器灯能量不足。
  8. 色谱柱硅或填料流失。
  1. 检查系统是否有松动的配件。检查泵是否有漏液、是否有盐析出和异常噪音。必要时更换泵密封件。
  2. 检查流动相的组成。
  3. 断开检测器和记录器的电源。请参阅使用指南来解决问题。
  4. 用强溶剂清刷系统。
  5. 清洗检测器。在检测器后面安装背压调节器。参考仪器手册，尤其是RI检测器部分（过高的背压会导致流通池破裂）。
  6. 清洗流通池。
  7. 更换灯。
  8. 更换色谱柱并清洁系统。

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问题15：宽峰

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 流动相组分发生变化。
  2. 流动相流速太低。
  3. 漏液（特别是在色谱柱与检测器之间）。
  4. 检测器设置不正确。
  5. 柱外效应：
    a. 色谱柱过载

    b. 检测器反应时间或流通池体积过大。

    c. 色谱柱与检测器之间的管线太长或管线内径太大。

    d. 记录器响应时间
    太长。

  6. 缓冲液浓度太低。
  7. 保护柱污染/失效。
  8. 色谱柱污染/失效。
  9. 色谱柱入口空洞。
  10. 所出现的峰代表两种或多种解析不良的化合物。
  11. 柱温过低。
  1. 重新制备新的流动相。
  2. 调节流速。
  3. 检查系统是否有松动的配件。检查泵是否有漏液，是否有盐析出和异常噪音。必要时更换泵密封件。
  4. 调节设置值。
  5. a. 注入较小的体积（例如10 μL，而不是 100μL）或以1:10或1:100的比例稀释样品。

    b. 减少响应时间或使用更小的流通池。

    c. 在可行的情况下，使用
    内径为0.007～0.010“的短管。

    d. 减少响应时间。

  6. 增加浓度。
  7. 更换保护柱。
  8. 换成同类型的新色谱柱。如果新柱未提供窄峰，则冲刷旧柱（表2），然后重新测试。
  9. 更换色谱柱，或打开入口端填补空洞。
  10. 更换色谱柱类型，以改善分离效果。
  11. 提高柱温。除非色谱柱制造商说明可采用更高的温度，否则温度不宜超过75℃。

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问题16：峰高变化（一个或多个峰）

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 一个或多个样品组分变质或色谱柱活性发生变化。
  2. 漏液，特别是在进样口与色谱柱入口之间。（保留时间也会改变。）
  3. 样品量不一致。
  4. 检测器或记录器设置被更改。
  5. 检测器灯能量不足。
  6. 检测器流通池污染。
  1. 采用新鲜样品或标样，以确认样品是否为问题的根源。如果某些或所有峰值仍小于预期值，则更换色谱柱。如果新的色谱柱改善了分析，则尝试运用适当的程序（表2），再生旧的色谱柱。如果性能未得到提高，则丢弃旧的色谱柱。
  2. 检查系统是否有松动的配件。检查泵是否有漏液、是否有盐析出和异常噪音。必要时更换泵密封件。
  3. 确保样品一致。
    对于固定体积定量环，使用2-3倍环体积以确保环被完全充满。确保自动进样器样品瓶中有充足的样品且没有气泡。检查进样针是否有空气。在具有洗涤或冲刷步骤的系统中，确保洗涤溶液不会沉淀样品组分。
  4. 检查设置。
  5. 更换灯。
  6. 清洗流通池。

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问题17：选择性发生变化

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 增加或减少溶剂离子强度、pH或添加剂浓度（特别影响离子溶质）。
  2. 色谱柱被更换，新色谱柱的选择性与旧色谱柱不同。
  3. 样品被注入错误的溶剂，或者过量注入强溶剂（100-200 μL）。
  4. 柱温发生变化。
  1. 检查流动相的组成。
  2. 确认色谱柱填料类型。对于可再现分析，使用相同的色谱柱类型。确定变化是否逐渐发生。如果是，则键合相可能已被剥离。色谱柱活性可能发生改变，或色谱柱可能已被污染。
  3. 调节溶剂。尽可能在流动相中注入样品。
  4. 调节温度。如果必要，使用柱温箱保持恒温。

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问题18：负峰

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 记录器导线反接。
  2. 溶质的折射率小于流动相（RI检测器）。
  3. 样品溶剂和流动相成分差异很大（空峰）。
  4. 流动相对紫外波长波段吸收率比样品组分更高。
  1. 检查极性。
  2. 使用折射率较低的流动相或反接记录器导线。
  3. 调整或更换样品溶剂。尽可能采用流动相稀释样品。
  4. a. 利用间接紫外线检测时，请调换极性，或

    b. 调整紫外线波长或使用不吸收所选波长的流动相。

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问题19：鬼峰

问题 可能的原因 纠正措施 / 建议

  1. 进样器或色谱柱污染。
  2. 样品中存在后期洗脱峰（通常为宽峰）。
  1. 在两次分析之间冲刷进样器（良好的常规操作）。如有必要，在柱中加入强溶剂以除去后期洗脱液。在梯度分析最后，加入清洗步骤，以去除强保留的化合物。
  2. a. 检查样品制备。

    b. 采用（分段）梯度以快速洗脱组分。

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