【Plant Biotech. J.】MdBBX22–miR858– MdMYB9/11/12模块调节苹果皮中原花青素的生物合成

文章信息

题目：The MdBBX22–miR858–MdMYB9/11/12 module regulates proanthocyanidin biosynthesis in apple peel

刊名：Plant Biotechnology Journal

作者：Bo Zhang, Zheng-Yang Zhao et al.

单位：Northwest A&F University

First published: 08 May 2022‍

摘要

原花青素 (PA) 具有抗氧化特性，对人体健康有益。苹果 ( Malus × domestica Borkh.) 的果实，尤其是果皮，富含多种类黄酮，如 PAs，是膳食抗氧化剂的重要来源。以往对苹果PAs调控的研究主要集中在转录水平，而在转录后水平的研究相对较少。在本研究中，研究了苹果果皮中 mdm-miR858（一种在植物发育中具有多种功能的 miRNA）的功能。研究者发现 mdm-miR858 通过靶向MdMYB9 / 11 / 12负调控 PA在果皮中积累。在果实发育过程中，mdm-miR858表达与MdMYB9 / 11 / 12表达和PA积累呈负相关。5'-RACE 实验、GUS 染色测定和瞬时荧光测定表明 mdm-miR858 切割并抑制MdMYB9 / 11 / 12的表达。苹果愈伤组织、烟草和拟南芥中 mdm-miR858 的过表达减少了由MdMYB9 / 11 / 12过表达诱导的 PA 的积累。此外，研究者发现 MdBBX22 与 mdm-miR858 启动子结合并诱导其表达。MdBBX22的过表达诱导mdm-miR858的表达抑制过表达MdMYB9 / 11 / 12的苹果愈伤组织中PAs的积累。在光胁迫下，MdBBX22 诱导 mdm-miR858 表达以抑制 PA 积累，从而间接增强果皮中花青素的合成。目前的结果表明，MdBBX22–miR858– MdMYB9 / 11 / 12模块调节苹果中 PA 的积累。该研究结果为进一步研究PA积累的调控机制以及PAs与花青素的关系提供了参考。

技术路线

主要结果

3.1 苹果皮发育过程中mdm-miR858的表达与PA积累呈负相关

在苹果'Starkrimson Delicious'果实的果皮发育过程中，儿茶素、表儿茶素、原花青素B1、原花青素B2和总PAs的含量在开花后30至60天（DAFB）迅速下降，从60至90 DAFB略有增加，随后下降。（图 1a,b）。

为了鉴定参与调节 PA 积累的 miRNA，在 30、60、90、120 和 140 DAFB 收集苹果皮样品并用于 sRNA 测序。总共鉴定了 5106 个独特的成熟 miRNA。所有 miRNA 分为三组：已知 miRNA (617)、保守 miRNA (60) 和新 miRNA (4429)。对这些 miRNA 的表达与总 PA 含量进行了相关性分析。188 种 miRNA（39 种已知 miRNA、7 种保守 miRNA 和 142 种新 miRNA）的表达与 PA 含量呈负相关（图 1c）。对其靶基因的预测显示，只有mdm-miR858、MdMYB9的预测靶基因/11 / 12，参与类黄酮生物合成。基于 sRNA 测序数据的 mdm-miR858 的表达模式通过 qRT-PCR 分析的结果得到验证（图 1d，e）。这些结果表明mdm-miR858可能参与了PA积累的调节。

3.2 mdm-miR858 靶向MdMYB9 / 11 / 12抑制苹果愈伤组织中 PA 的积累

研究者使苹果皮和苹果愈伤组织中的 MdMYB9、MdMYB11和MdMYB12沉默。沉默MdMYB9、MdMYB11和MdMYB12分别降低了苹果皮和苹果愈伤组织中的总 PA 含量；然而，当MdMYB9、MdMYB11和MdMYB12同时沉默时，总 PA 含量下降更显着。这些结果表明 MdMYB9、MdMYB11 和 MdMYB12 在调节 PA 方面具有功能冗余。为了验证 mdm-miR858 抑制 PA 积累，产生了 MdMYB9 -OX、MdMYB11 -OX 和MdMYB12 -OX 的过表达愈伤组织。在用 4-二甲氨基肉桂醛 (DMACA) 染色后，MdMYB9 -OX、MdMYB11 -OX 和MdMYB12 -OX 愈伤组织被染成紫色（图 4a）。定量逆转录 PCR (RT-qPCR) 分析显示MdMYB9、MdMYB11和MdMYB12在MdMYB9 -OX、MdMYB11 -OX 和MdMYB12中的表达与野生型愈伤组织相比，-OX愈伤组织显着增加（图 4b）。HPLC分析表明，MdMYB9-OX、MdMYB11-OX和MdMYB12-OX愈伤组织中儿茶素、表儿茶素、原花青素B1、原花青素B2和总PAs的含量高于野生型愈伤组织（图 4c）。当 mdm-miR858 在MdMYB9 -OX、MdMYB11 -OX 和MdMYB12 -OX 愈伤组织中过表达时，MdMYB9、MdMYB11和MdMYB12在 mdm-miR858-OX/ MdMYB9 -OX、mdm- miR858-OX/ MdMYB11中的表达水平显着降低（图 4b）。用 DMACA 染色后，mdm-miR858-OX/ MdMYB9 -OX、mdm-miR858-OX/MdMYB11-OX 和mdm -miR858-OX/ MdMYB12 -OX愈伤组织中不存在紫色（图 4a）。与MdMYB9- OX、MdMYB11- OX和MdMYB12- OX愈伤组织相比，儿茶素、表儿茶素、原花青素B1、原花青素B2和总PA含量显着降低（图 4c）。

3.3 MdBBX22诱导mdm-miR858的表达抑制PA积累并改变代谢过程以增强光胁迫下苹果皮中花青素的合成

MdBBX22 是苹果中的一种光响应转录因子。这使我们推测 MdBBX22 可能调节 mdm-miR858 的表达，从而影响光胁迫下的 PA 积累。首先，苹果果实在 45 DAFB 时被装袋，在 120 DFAB 时，水果被打开并放置在光照培养箱中暴露在连续光照下。光胁迫下总 PA 含量降低，而花青素含量增加（图 8a）。RT-qPCR 分析显示MdBBX22和mdm-miR858的表达在光胁迫下增加，而MdMYB11和MdMYB12的表达在光胁迫下减少（图 8b），并且MdMYB9总是表现出低表达水平。这些结果表明，MdBBX22可能通过在光胁迫下上调mdm-miR858的表达参与PA的调节。

为了验证 MdBBX22 可以诱导 mdm-miR858 的表达以抑制光胁迫下苹果皮中 PA 的积累，我们在苹果皮中通过瞬时转化，过表达了 MdBBX22 、MdBBX22 （图8c），MdBBX22 -OX 苹果皮中的花青素含量增加（图8d，f），而MdMYB11和MdMYB12的过表达系中总 PAs 的含量降低（图 8e，f），而MdMYB11和MdMYB12的过表达体总 PA 的含量增加（图 8e，f）。这些结果表明 MdBBX22 诱导 mdm-miR858 的表达以抑制光胁迫下苹果皮中 PA 的积累。

3.4 mdm-miR858 靶向MdMYB9 / 11 / 12抑制烟草和拟南芥中 PA 积累

为了验证 mdm-miR858 靶向MdMYB9 / 11 / 12以抑制 PA 积累，研究者在烟草和拟南芥中过表达MdMYB9 / 11 / 12。mdm-miR858-OX/ MdMYB9 -OX、mdm-miR858-OX/ MdMYB11 -OX和mdm-miR858-OX/ MdMYB12 -OX烟草花中花青素含量增加。然而，儿茶素、表儿茶素和总 PA 的含量下降，而其他黄酮醇的含量保持不变。

当将MdMYB9 / 11 / 12转移到拟南芥tt2突变体中时，种皮的颜色变为棕色，并且 DMACA 将种皮染色为蓝黑色（图 5a）。MdMYB9- OX/ tt2、MdMYB11 -OX/种子中PA含量及MdMYB9、MdMYB11、MdMYB12的相对表达量与tt2突变体相比，tt2和MdMYB12 -OX/ tt2拟南芥显着增加（图 5b，c）。当mdm-miR858转化为MdMYB9 - OX/ tt2、MdMYB11 -OX/ tt2和MdMYB12 - OX/ tt2拟南芥时，mdm-MIR858（pre-mdm-miR858）和mdm-miR858大量表达（图 5c)，种皮是浅黄色并且没有被DMACA染色(图 5a )。总PAs含量及MdMYB9 / 11/ 12在种子中显着减少（图 5b，c）。此外，与拟南芥MdMYB9-OX/ tt2、MdMYB11- OX/ tt2和MdMYB12 -OX/ tt2相比， AtDFR、AtANS和AtANR的表达显着降低（图 5d）。

结论

总之，本研究表明，mdm-miR858可以靶向MdMYB9 / 11 / 12从而抑制PAs的积累。在光胁迫下，MdBBX22与mdm-miR858启动子结合，通过靶向MdMYB9 / 11 / 12诱导mdm-miR858表达抑制PA积累，抑制PA分支促进苹果果皮中花青素的快速合成。研究结果揭示了转录后水平上 PA 合成的新调控机制。此外，本研究结果阐明了轻胁迫下苹果皮中 PAs 和花青素之间的关系。

获取原文

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13839

补充材料：

https://onlinelibrary.wiley.com/action/downloadSupplement?doi=10.1111%2Fpbi.13839&file=pbi13839-sup-0001-FigureS1-S14.pdf

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