来源：Cytiva思拓凡

未来随着制药企业在生物制剂领域的投入，预计至 2021 年全球生物药市场都将按照复合年增值率 19% 的速度增长，以市场微末计算，2021 年将达到 200 亿美元。中国生物药市场由于基数小，增长空间将会更大，增速也会更加强劲，预计 2021 年中国生物制剂市场规模将达到 92 亿人民币，随着国内生物类似药陆续上市，将有望呈现爆发式增长。

CHO 细胞因其能够快速、高水平的表达多种重组蛋白，使用悬浮培养工艺易于放大培养，在生物制药领域中被广泛应用于生产治疗型蛋白。

在细胞培养工艺开发时，所用物料在满足细胞的营养需求外，要完全符合 cGMP 的规定，选择无动物源成分的化学成分限定的培养基，且满足基因型扩增和相应筛选系统的培养条件。

通常所用培养基可以分为传代培养基、生产培养基及补料培养基。传代培养基营养成分相较于生产培养基营养成分较为丰富，有利于细胞活性的恢复。补料培养基通常为氨基酸的复合物，且根据氨基酸的等电点差异分别流加，避免析出。在培养基之外还需准备相应的碳源补充料，一般为葡萄糖。此外在选择物料时还要综合考虑大规模培养的普适性和操作性。

 小试阶段 

在摇床的选择上要考虑到细胞对 OTR、蒸发量的需求，通常在转移细胞培养工艺时会遇到双方摇床不一致的问题，导致 OTR 出现偏差，可以根据摇床的轨道半径做一个简单向心力的换算，再通过实验进行验证。

F：向心力-N; m：质量-g; n：转速-rpm; r：轨道半径-mm

在细胞生产放大过程中通常会根据规模的不同决定种子罐的级数及规模。

以 200 L 中试规模为例，通常会用到一级 50 L 的种子罐，此时需要考虑放大过程中的工艺参数设定，可以分别通过 KLa、P/V、tip speed、科莫微尺度及 CO₂ 逃逸速度建模及混匀时间综合考虑，分别设定种子罐及生产罐的转速、底部通气类型及流量、表面通气流量，以及在培养过程中氧气、空气、二氧化碳的调控。

通常 KLa 在 5~12 h^-1 即可实现较高密度的细胞培养；KLa 通常是在 P/V 基础上进行调整确定；哺乳动物细胞培养时 tip speed 通常控制在 2 m/s 以下，降低细胞受到剪切力的伤害；科莫微尺度应大于细胞直径的 50 倍，从而减小剪切力对细胞的伤害。

基于以上原则进行的一次放大试验如下：

一

细胞复苏与摇瓶扩增

1.1

将传代培养基(CD CHO)置于室温，使其温度恢复至室温后再转入 37.0℃ 摇床内预热 30 min；

1.2

利用移液器将种子细胞液从冻存管内吸出打入装有预热培养基的摇瓶内，摇床参数设置如下：

1.3

复苏后细胞密度为 0.31*10e6 cells/mL，活率为 92.4%；

1.4

N-2~N-1 由 WAVE 反应器进行扩种，所用反应袋规格分别为 20 L、50 L。扩增阶段实验结果如下：

N-5~N-3 阶段的稀释比为 14，活率由 97.2% 提高到 99.5%，细胞生长较为稳定，比生长速率为 0.86~0.88 day^-1。

N-2~N-1 阶段采用 ReadyToProcess WAVE 25 反应器后，活率稳定在 99% 以上，比生长速率分别为 0.88 day^-1、0.87 day^-1，与摇瓶相比稳定性良好，未发生由于反应器、容器的更换而导致比生长速率发生变化。ReadyToProcess WAVE 25 参数设定如下：

二

XDR-200 一次性生物反应器生产

 2.1  生产前分别对 pH(4.01 和 7.00)、DO(0 和 100%)、温度电极进行两点校正；

 2.2  将生产培养基 ActiPro 打入 XDR 200 L 反应袋内预热到 37℃ 后进行接种，接种后活细胞密度为 0.45*10e6 cells/mL；

 2.3  每天检测葡萄糖及乳酸浓度，当葡萄糖与乳酸浓度之和小于 4 g/L 时，流加葡萄糖溶液到培养液中葡萄糖浓度为 4 g/L；

 2.4  分别在第 3 天、第 5 天、第 7 天、第 9 天流加 3% 的补料培养基 cell boost 7a 和 0.3% 的 cell boost 7b，向培养液中补充氨基酸。

三

实验结果

细胞密度变化如图 1。在 200L 的实验中，在第五天细胞密度为 17*10e6 cells/mL 时，调节温度到 31.0℃，比生长速率变低，在第 7 天达到最高值 24.87*10e6 cells/mL，此后稳定在 22*10e6 cells/mL ~24*10e6 cells/mL 之间。

图 1 细胞密度变化

图 2 细胞活率变化

葡萄糖及乳酸浓度变化如图 3、4，葡萄糖在细胞指数生长期被快速利用，从而产生大量的乳酸，在第 4 天达到峰值 2.03 g/L。此后由于补糖策略的优化，乳酸浓度逐渐下降，但在收获当天仍含有 0.38 g/L，培养工艺需进一步优化。细胞活率由于乳酸的影响，在第 4 天以后逐渐降低，截至收获当天活率为 95.4%。

图 3 葡萄糖浓度变化

图 4 乳酸浓度变化

第 12 天降温到 20℃ 后进行细胞液收获时，细胞密度为 23.59*10e6 cells/mL，IgG 产量达 4.3 g/L，与 15 L 实验结果较为一致。XDR 生物反应器设置参数如下：

生物反应器在中国大规模应用上仍处于起步阶段，随着现代生物技术发展，利用生物反应器进行生物制品生产是行业发展的必然趋势。利用生物反应器悬浮培养细胞生产抗原、抗体等是生物制品的核心技术，结合筛选驯化的高表达细胞株和精细化的放大工艺控制，从而能够有效提高生产效率、产品质量和降低成本，提高产品竞争力。

参考文献

1) Stoker, Emily B., "Comparative Studies on Scale-Up Methods of Single-Use Bioreactors" (2011). All Graduate Theses and Dissertations. 889.

2) An Zhanga, Valerie Liu Tsanga, Rashmi Korke-Kshirsagarb, Thomas Ryll b.Effects of pH probe lag on bioreactor mixing time estimation.Process Biochemistry 49 (2014) 913–916

3) Sánchez Oscar, Guío Felipe, García Diana, Silva Edelberto, Caicedo Luis, Oxygen transfer, mixing time and gas holdup characterization in a hybrid bioreactor, Proceedings of European Congress of Chemical Engineering (ECCE- 6) Copenhagen (2007) 16 - 20.

4) Dimiter Hadjiev, Nour Eddine Sabiri, Adel Zanati, Mixing time in bioreactors under aerated conditions. Biochemical Engineering Journal 27 (2006) 323–330

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