细胞工程-5-植物细胞培养和次生代谢产物生产
植物细胞培养（plant cell culture）是指在离体条件下对植物单个细胞或小细胞团进行培养并使其增殖的技术。
目录
第一节 植物单细胞培养技术
一、单细胞分离
二、单细胞的培养技术
第二节 植物细胞的大规模培养
一、植物细胞的悬浮培养
（一）悬浮培养技术
（二）悬浮细胞的同步化
（三）悬浮培养中细胞生长量的计算
二、植物细胞的固定化培养
第三节 植物细胞生物反应器
一、植物细胞悬浮培养生物反应器
（一）机械搅拌式生物反应器
（二）气升式反应器
二、植物细胞固定化生物反应器
（一）植物细胞固定化培养的概念
固定化培养的特点
第四节 植物细胞培养生产次生代谢产物
1.优良细胞系的选择
2、种子细胞系的增殖培养
3、大规模培养体系的建立
4、次生代谢产物的提取分离
二、提高植物次生代谢产物生产效率的途径 （P103-106）
毛状根培养技术
冠瘿瘤培养技术
反义技术：导入反义RNA，抑制表达。
植物细胞大规模培养存在的问题及发展
思 考 题
第一节 植物单细胞培养技术
单细胞培养是从外植体、愈伤组织或者细胞团中分离得出的单细胞，然后在一定条件下对其进行培养的过程。
通过植物单细胞培养可对单个细胞进行细胞分裂、分化、生长和增殖过程的定点观察，从而进行定点分析和选择。
一、单细胞分离
机械法：介质保护细胞防止。不会受到酶的伤害；
酶解法：纤维素和果胶酶；获得大量细胞；
花粉细胞要用胼胝质酶；
二、单细胞的培养技术
植物细胞具有群体生长特性。
培养组织分离单细胞：
常用：愈伤组织；振荡培养的方法。
单细胞培养：
平板培养：将单细胞悬浮液用网眼合适的细胞筛过滤获取适于平板培养的细胞悬液，细胞记数之后，
植板率=(每个平板上形成的细胞团数/每个平板上接种的细胞总数)×100%
悬浮培养：大规模生产、代谢产物；分散性良好、均一性号、细胞生长迅速。
看护培养：活跃生长的愈伤组织、其他组织哺育培养，使其正常增值。滤纸保持湿润。少量细胞。
微室培养：单个细胞进行观察、分裂和生长，短期。
饲养层培养：将处理过的细胞分裂能力慢的细胞进行哺育。
条件培养：预先培养过其他组织的液体培养基进行培养。提供有用的物质。
接种量存在最低临界值
第二节 植物细胞的大规模培养
悬浮培养和固定化培养
一、植物细胞的悬浮培养
（一）悬浮培养技术
分批培养（一次加、一次取，S形曲线）搅拌、一次性；
连续培养：持续加入、持续产出、稳定、细胞保持对数生长期。营养物质利用率低、分裂快、易变异。
封闭式：细胞流出之后再倒入原先培养液；开放式：细胞随着流出、细胞数目稳定，
PS：确定细胞浓度的方法：浊度恒定法、化学恒定法
半连续培养：反应器中投料和接种培养一段时间，将细胞悬液移出部分，再加入新鲜培养液进行培养的方法，细胞连续生长。
（二）悬浮细胞的同步化
物理法：分选法、冷处理法
化学法：饥饿法、抑制法
（三）悬浮培养中细胞生长量的计算
有丝分裂指数：MI、有丝分裂占总细胞。
（四）细胞活力测定
染色、形态学观察（相差显微镜）、胞质环流的存在、伊凡蓝染色、
荧光素双乙酸酯，受到细胞内酯酶作用分解荧光素。
甲苯安澜-表皮细胞、酚红
二、植物细胞的固定化培养
（一）植物细胞固定化培养的概念
是将游离的细胞包埋或吸附到一种惰性基质的特定空间内或表面上，培养液呈流动状态进行培养的技术。
优点：包埋在聚合物，减少剪切力损伤；生长慢促进次生代谢产物的产生；固相化使产物更容易收集；使细胞与细胞之间紧密接触。
（二）植物细胞固定化技术
包埋式：琼脂、藻酸盐、胶原蛋白。
固定式：尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维。
特点：位置固定、刺激代谢产物。
第三节 植物细胞生物反应器
一、植物细胞悬浮培养生物反应器
植物细胞培养特点：体积大、易于聚集、生长慢、临界密度、（10^3-10^5）、细胞壁薄、需氧量低。
（一）机械搅拌式生物反应器
叶轮搅拌式、螺旋搅拌式。
（二）气升式反应器
气动式：内循环和外循环、鼓泡式（剪切力更小、适于更敏感的细胞）
二、植物细胞固定化生物反应器
（一）植物细胞固定化培养的概念
细胞固定化培养（cell immobilization culture）
就是将游离的细胞包埋或吸附在惰性介质的内部或表面，培养液在细胞间流动的培养方式。
实现连续培养、连续收集培养产物。
培养设备：固定化生物反应器。
分为两种：
包埋式固定化培养系统：常用的支持物有琼 脂、琼脂糖、藻酸盐、胶原蛋白、聚丙烯酰胺 等；
附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、 聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。
反应器：流化床反应器、填充床生物反应器、膜生物反应器（效率高）
固定化培养的特点
- ✓细胞位置固定，避免了剪切力的影响。
- ✓固定化细胞生长缓慢，次生代谢占优势，导致次生代谢产物产量增高。
- ✓相互间接触密切，可以形成一定的理、化梯度，有利于次生产物的合成。
- ✓便于次生产物的收集，消除产物对细胞代谢的反馈抑制。
- ✓固定化细胞可以反复使用，进行连续生产，培养条件易控制，细胞稳定性高。
植物细胞固定化培养的缺陷：
细胞代谢产物必须分泌到细胞外，但多数次生代谢产物是存在于细胞内的，为了促进次生代谢产物的合成和分泌，需要借助物理或化学方法提高细胞渗透性，促进产物的释放。
植物细胞次生代谢产物的积累是不连续的，限制了其应用
第四节 植物细胞培养生产次生代谢产物
植物次生代谢产物(secondarymetabolites)：是指生物体利用某些初级代谢产物为“原料”，
在一系列酶的催化下，形成的一些特殊的化学物质。
❖这类物质非植物生长、发育所必需，对植物的生态适应有重要作用，具有生物活性。
初级代谢产物：蛋白质、氨基酸
次级代谢产物：不是必须的，具有生物活性。
有效途径-生物反应器
获得途径：
- 直接从野生或栽培的植株种分离提取；
- 人工合成；
- 微生物（细菌或真菌）发酵；
- 植物细胞规模化培养；
利用植物细胞大规模培养生产有用物质的技术要求
➢ 培养技术：
✓ 培养的细胞遗传稳定；
✓ 细胞生长及生物合成的速度快；
✓ 代谢产物要在细胞中积累。
➢ 工程角度：
适宜于植物细胞生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。
1.优良细胞系的选择
外植体选择——愈伤组织诱导——单细胞培养——不同单细胞克隆系——成分分析（取愈伤组织）——高产细胞系筛选和保存；
适当增加选择压力或人工诱变的方法进行优良高 产突变细胞系的选择。
适于工业化生产的细胞系的要求
- ❖分散性好，适合大规模悬浮培养；
- ❖ 均一性好，细胞大小、生理状态一致；
- ❖ 生长速度快，培养周期短，不易染菌；
- ❖ 目标产物含量高，容易分离提取；
- ❖ 细胞遗传稳定。
2、种子细胞系的增殖培养
种子细胞的增殖培养是建立细胞大规模培养体系的中间环节。是为了获得大量的活跃生长的细胞群体。方法：通过悬浮培养，体积逐步放大。
在培养过程中对细胞的生长特性及产物含量不断检测，模拟大规模培养控制条件，为后期培养提供技术参数。
3、大规模培养体系的建立
利用大型生物反应器，进行细胞的规
模化培养和产物的生产：
悬浮培养体系
固定化培养体系
4、次生代谢产物的提取分离
培养结束后，根据目的产物的分布，分别收集培养液和细胞，如果目的产物存在于细胞内，要经过细胞破碎之后再分离提取；如果分泌到培养液中，直接通过浓缩培养液分离提取。
二、提高植物次生代谢产物生产效率的途径 （P103-106）
次生代谢产物产量的提高和条例优化需要结合具体的对象与目的产物进行，需要考虑的因素如下：
- 细胞系：选择稳定高产的细胞系；
- 培养工艺：诱导子的添加、前体饲喂、增加竞争途径代谢产物抑制剂、培养基和培养条件优化和控制等。
- 培养技术：固定化培养技术、两步培养法、两相培养技术。
- 培养设备：选择或设计合适的生物反应器
适宜外植体选择：筛选生长迅速、次生产物合成能力高的细胞系是细胞大量培养中降低成本、提高产率的重要途径。
培养基：一是满足细胞的生物量的增长，二是使细胞合 成和积累次生产物。
前体是指处于目的代谢物代谢途径上游的物质。在培养基中加入廉价的外源前体物质，可以使目的产物的产量大大提高。
诱导子是指能够诱导植物细胞特有次生代谢产物积累的因 子。 诱导子通常能够快速的、高度专一性和选择性的诱导特异 基因的表达，提高次生代谢产物的合成。
生物诱导子：各种病原菌、植物细胞壁的分离物；
非生物诱导子：主要是物理或化学因子，如重金属盐类、 高盐浓度、抗生素、寒冷或受热、乙烯、杀菌剂、紫外射线等
两步培养法：细胞生长培养基、生产培养基；
两相法：培养相和吸附相
毛状根培养技术
毛状根是植物各器官受发根土壤杆菌感 染后诱导形成的类似毛发状的根组织，毛状 根培养是80年代发展起来的基因工程与细胞 工程相结合技术。
具有激素自养，增殖速度快，次生代谢产 物含量高且稳定等特点。
冠瘿瘤培养技术
通过根瘤农杆菌感染植物后可以诱导植物 形成冠瘿组织。冠瘿组织离体培养时也具有激 素自主性、增殖速率、遗传性状稳定等特点， 其次生代谢产物合成稳定性与能力较强。
反义技术：导入反义RNA，抑制表达。
次生代谢产物的代谢途径常常是植物的分支代 谢之一。因此抑制与细胞生长和目的产物积累 无关的分支代谢途径是提高产率的一个重要方法。
植物细胞大规模培养存在的问题及发展
存在问题
技术问题： ❖植物细胞培养：细胞特性不利于大规模培养 ❖生物反应器：如何适应植物细胞培养
经济问题：成本过高
发展趋势
高效细胞系的筛选
培养基优化
生物反应器研究
两相培养、固定化技术研究
基础研究：细胞分化、离体培养中次生代谢产 物生成途径等
❖重点掌握：单细胞培养技术，悬浮培养的特点、良好悬浮系的特征及细胞 生长量的计算，提高培养细胞次生代谢产物的途径
思 考 题
1.植物单细胞培养的方法有哪些？
2.一个好的悬浮细胞系有哪些特征？
3. 植物细胞大规模培养有哪些培养系统？各有什么特点？
4. 植物细胞固定化的常用方法有哪些？为什么说植物细胞固定化培养更有利于次生生物的生成？
5. 培养条件下植物细胞生长与次生产物合成的关系有哪几类？
6.影响植物次生产物合成的因素有哪些？通过哪些途径可以 提高植物培养细胞次生代谢产物的产量
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