#cut NAT sample
#-u 20(正值u表示切除R1的前20个碱基) -u -30（负值u表示切除R1的前20个碱基）/
#-U 20(正值U表示切除R2的前20个碱基) -U -30 (负值U表示切除R2的前20个碱基) /
#-m 30（丢弃碱基数小于30的reads）-j 6（6个线程，并行加速作用）
#-a read1的正向接头序列；-A read2的反向接头序列
nohup cutadapt -a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC -A AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT /
-u 20 -u -30 -U 20 -U -30 -m 30 -j 6 /
-o /data2/xxx/data2/2cutadapt/NAT-RNA_combined_clean_R1.fastq /
-p /data2/xxx/data2/2cutadapt/NAT-RNA_combined_clean_R2.fastq /
/data2/xxx/data2/rawdata/NAT-RNA_combined_R1.fastq /
/data2/xxx/data2/rawdata/NAT-RNA_combined_R2.fastq >cutadapt2.log 2>&1 &

cd /data2/xxx/data2/mm10
nohup bowtie2-build mm10_genome.fa mm10_index  >bowtie2-build.log 2>&1 &

#比对NAT sample
#-G gtf文件；-o bowtie建立参考基因组索引的公共名（前缀）；
nohup tophat2 -p 6 -G /data2/xxx/data2/mm10/gtf/mm10_genes.gtf /
-o ./NAT /data2/xxx/data2/mm10/mm10_index/mm10_genome_bowtie2  /
/data2/xxx/data2/2cutadapt/NAT-RNA_combined_clean_R1.fastq /
/data2/xxx/data2/2cutadapt/NAT-RNA_combined_clean_R2.fastq >NAT.log 2>&1 &

#1、cufflinks 转录本组装(NAT sample)
#bam文件是tophat2比对输出结果文件
cd /data2/xxx/data2/4cufflinks/NAT
nohup cufflinks -o ./ -p 8
../../3tophat/NAT/accepted_hits.bam >NAT.log 2>&1
#2、cuffmerge 组装后的转录本合并
#assembly_list 是文本文件，里面包含cufflinks的两个gtf结果文件路径 /
#/data2/xxx/data2/4cufflinks/CA/transcripts.gtf /
#/data2/xxx/data2/4cufflinks/NAT/transcripts.gtf
cd /data2/xxx/data2/4cufflinks
nohup cuffmerge -o ./merge/ assembly_list.txt -p 8 > merge.log 2>&1 &
#3、cuffquant 转录本定量
#-u 同时对比对上基因组上多个位置的reads进行统计分析
#参考基因组mm10的gtf注释文件； tophat2的比对结果bam文件
cd /data2/xxx/data2/4cufflinks/3quantity/NAT
nohup cuffquant -p 8 -u /data2/xxx/data2/mm10/gtf/mm10_genes.gtf /
/data2/xxx/data2/3tophat/NAT/accepted_hits.bam >NAT.log 2>&1 &
#4、cuffdiff 差异分析
#-b 参考基因组mm10的基因组序列
#-u 对多比对位置的read加权然后分配比对到基因组上
#-L 样本名
nohup cuffdiff -b /data2/xxx/data2/mm10/mm10_genome.fa /
/data2/xxx/data2/4cufflinks/2merge/merged.gtf /
-u -L CA,NAT /data2/xxx/data2/3tophat/CA/accepted_hits.bam /data2/xxx/data2/3tophat/NAT/accepted_hits.bam /
-p 8 -o ./ >cuffdiff.log 2>&1 &