1. NCBI 的 Primer-Blast

这个工具整合了目前流行的 Primer3 软件，且加上 NCBI 的 Blast 进行引物特异性的验证；可以针对某一特定剪接变异体基因来设计引物。
网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 或者直接从 Blast 主页（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）上找到。
Primer-Blast 的界面包括 4 个部分：
◆ PCR Template（模板区）
◆ Primer Parameters（引物参数区）
◆ Exon/intron Selection（外显子内含子设置）
◆ Specificity check（特异性验证区）

设计引物，输入目的模板，Accession number / Gi number / FASTA 格式。
验证引物
外显子内含子：如果设计的引物是跨内含子和外显子的交界处，可在此处设置成为 Primer must span an exon-exon junction。外显子的匹配碱基数和内含子的长度等设置一般选择默认。
特异性（Specificitycheck）选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。（重要）
◆ 提供了 7 种数据库：RefSeq mRNA，Genome (reference assemblies from selected organisms)，RefSeqrepresentative genomes，RefSeq RNA(refseq_rna)，nr (the standard non-redundant database)，Genome (chromosomesfrom all organisms) 和 custom。
◆ 前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。
◆ 特别是，当你用 NCBI 的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST 可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。
建议用 oligo6 或 primer5 验证引物自身的特性：发夹结构、引物自身二聚体、错配和引物间二聚体，△G 的绝对值。

2. Primer3 Plus

严格的 qPCR 引物设计一般要求其中一条引物要跨外显子，最好在 3‘端设计引物，产物的长度在 300bp 以内等。本在线软件可满足 qPCR 引物设计的要求。http://www.primer3plus.com/
1、Main：合理的使用 <排除的区域>，［目的扩增区域］，｛包含的区域｝符号使引物设计符合自己的要求。
2、General Settings：避免多个重复碱基出现，避免 4 个或超过 4 个 G 出现在引物序列中。
按照荧光定量引物要求设置参数，如：
产物长度：不应该超过 400bp，最好 100-150bp；
GC％：30％-70%，最好 45%－55%；
引物长度：18-25bp，最好 22-24bp；
TM 值：58-60℃，最好 60℃；
3’端：3’端至少 4 个碱基保守，最好为 T，C，G。
3、点击右上绿色按钮Pick Primers，可获得若干对引物，并按照 5’到 3’的顺序，包含了引物和产物的一些基本参数。可以根据荧光定量引物要求，尽量选择 G、C 结尾的引物合成，如下图中红框所示，还可以在序列图中看到引物的位置。
4、设计好引物后，要进行 NCBI blast 引物验证，进入 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，在下面框中，按照 5’－3’ 顺序，分别输入上游引物和下游引物，上下游引物之间间隔 20 个以上 n。
5、选择物种数据库，如 Human，Mouse 或者 Others（如果是非人和非小鼠物种）。
6、选择 Somewhat similar sequences (blastn)
7、点击 Algorithm parameters, 在 Expect threshold 输入 1000，在 Word Size 输入 7。Word size 不是字体大小的意思，应该理解为读长，按照 7 个一组核苷酸序列放到 GeneBank 中进行比对。
8、点击 BLAST，开始比对，出现结果，颜色代表得分。
选择引物的原则是：列表中大部分是目的基因，说明引物特异性高；但是可能物种不同，说明该基因在不同物种中保守。

3. PrimerBank

PrimerBank 是哈佛大学的一个 qPCR 引物数据库，目前有超过 20 万条引物，涵盖了人和小鼠大部分已知的基因。根据网站上对两万多对引物的验证结果，引物有效率为 82.7%。尽量选择这种验证过的 qPCR 引物，qPCR 品质比较有保障。http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
搜索类型这里，可以根据 GenBank accession、NCBI protein accession、NCBI gene ID、primerbank ID、NCBI gene symbol 以及 keyword 六个选项进行搜索。以小鼠的 beta-actin 为例。
1、到 NCBI-Gene 上找出 β-actin 的 gene ID，点击右边的分类 mus musculus，结果就出来了，小鼠 beta-actin 的 NCBI gene ID 是 11461，Actb 则是小鼠 beta-actin 的 NCBI gene symbol。
2、把 11461 输入到 primerbank 里，在这个结果上我们可以看到 beta-actin 的 NCBI gene ID、GenBank accession、NCBI protein accession、coding DNA length 等信息。输入 beta-actin 的 NCBI gene symbol：Actb，也可以得到相同的结果。
3、往下拉能看到经过验证的引物：
4、点进去可以看到熔解曲线、电泳结果等信息：

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1. NCBI 的 Primer-Blast

2. Primer3 Plus

3. PrimerBank

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