（单细胞-SingleCell）拟时序分析-细胞轨迹追踪

在细胞轨迹分析中，仅需要准备三个数据即可

原始count数据
样本的meta信息
基因信息

准备三个数据的主要原因是将seurat对象装换为monocle对象

创建好monocle对象后仅需要走差异基因流程和排序流程就可以进行细胞轨迹追踪

# clear
if(T){rm(list=ls())setwd("C:\\Users\\yuansh\\Desktop")dir()
}# options
if(T){options(stringsAsFactors = F)options(as.is = T)
}# packages
if(T){library(stringr)library(magrittr)library(ggplot2)library(Seurat)library(devtools)library(clustree)library(tidyverse)library(gridExtra)library(ggridges)library(ggplot2)library(ggExtra)library(monocle)}# myfunctions
if(T){myhead = function(x){if(dim(x)[2]>5){return(x[1:5,1:5])}else(head(x))}myscale = function(x, scale_factor){(x / sum(x)) *scale_factor}
}# set work-dir
setwd('C:\\Users\\yuansh\\Desktop\\DLTumorCell\\code')# main
# 导入数据并预处理
load("../processfile/S03_Merged_main_filtered_with_neo_osi.RData")
sce = main_tiss_filtered1
rm(main_tiss_filtered1)
if(T){sce@meta.data$sample_name <- as.character(sce@meta.data$sample_name)sample_name <- as.character(sce@meta.data$sample_name)# Make table tab.1 <- table(sce@meta.data$sample_name) # Which samples have less than 10 cells samples.keep <- names(which(tab.1 > 10))metadata_keep <- filter(sce@meta.data, sample_name %in% samples.keep)# Subset Seurat object sce <- subset(sce, cells=as.character(metadata_keep$cell_id))scetable(sce@meta.data$sample_name)table(sce@meta.data$patient_id)#save(sce, file=paste(dir,"S03_subset_preprocessed.RData", sep=""))
}# 剔除组织样本中少于10个细胞的组织
sce
# 导入注释信息
pre.label = read.csv("../processfile/train-predict.csv",row.names = 1)# 这里注意一下，轨迹追中只需要上皮细胞
use.cells  <- row.names(pre.label)
sce <-subset(sce, cells=use.cells)  # 从原始数据中获取非免疫细胞表达矩阵
pre.label = pre.label$PredictLabel %>% as.data.frame() %>% set_rownames(rownames(pre.label))
sce = AddMetaData(sce,metadata = pre.label,col.name = 'prelabel')# 轨迹追踪准备数据
# 1.原始count数据
count = sce@assays$RNA@counts %>% as.matrix()
# 2.基因信息
gene_ann <- data.frame(gene_short_name = row.names(count), row.names = row.names(count)
)
# 3.样本注释信息
sample_ann = data.frame(group = sce@meta.data$prelabel,row.names = rownames(sce@meta.data)
)
# 初始化配置文件
pd <- new("AnnotatedDataFrame",data=sample_ann)
fd <- new("AnnotatedDataFrame",data=gene_ann)
# 穿件对象
cds <- newCellDataSet(count, phenoData = pd,featureData =fd,expressionFamily = negbinomial.size(),lowerDetectionLimit=1)
cds# 初始化对象信息
cds <- estimateSizeFactors(cds)
cds <- estimateDispersions(cds)# 识别差异基因
# 注意这一步需要很长的时间
if(F){disp_table <- dispersionTable(cds)unsup_clustering_genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.1)cds <- setOrderingFilter(cds, unsup_clustering_genes$gene_id)dim(cds)diff_test_res <- differentialGeneTest(cds,fullModelFormulaStr = "~group")# 哪怕仅仅是65个单细胞，monocle的这个differentialGeneTest函数运行也不快。ordering_genes <- row.names (subset(diff_test_res, qval < 0.01))save(ordering_genes,file = '../processfile/ordering_genes_by_Biological_Condition_high.Rdata')
}
#导入轨迹分析需要的差异基因
# load(file = 'ordering_genes_by_Biological_Condition_high.Rdata')cds <- setOrderingFilter(cds, ordering_genes)
plot_ordering_genes(cds)
# 然后降维
cds <- reduceDimension(cds, max_components = 2,method = 'DDRTree')
# 降维是为了更好的展示数据。
# 降维有很多种方法, 不同方法的最后展示的图都不太一样, 其中“DDRTree”是Monocle2使用的默认方法
# 接着对细胞进行排序
cds <- orderCells(cds)
## 最后两个可视化函数
plot_cell_trajectory(cds, color_by = "prelabel")
ggsave('../plot/normal-tumor-trace.pdf',width = 8,height = 8)
# 可以很明显看到细胞的发育轨迹
# 还有几个其它可视化函数，我们明天介绍
plot_cell_trajectory(cds, color_by = "State")
plot_cell_trajectory(cds, color_by = "Pseudotime")
plot_cell_trajectory(cds, color_by = "State") +facet_wrap(~State, nrow = 1)

流程非常非常简单，感觉没什么好说的如果有不懂的可以通过以下的方式联系我

Best Regards,
Yuan.SH
---------------------------------------
School of Basic Medical Sciences,
Fujian Medical University,
Fuzhou, Fujian, China.
please contact with me via the following ways:
(a) e-mail :yuansh3354@163.com

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