题目：胃活检样本中幽门螺杆菌单细胞鉴定、药敏试验和全基因组测序的临床抗菌敏感性测试

Single-Cell Identification, Drug Susceptibility Test, and Whole-genome Sequencing of Helicobacter pylori Directly from Gastric Biopsy by Clinical Antimicrobial Susceptibility Test Ramanometry

Clinical Chemistry [IF=9.599]

DOI：https://doi.org/10.1093/clinchem/hvac082

发表日期：2022-06-20

第一作者：刘敏、朱鹏飞、张磊

通讯作者：张建中、徐健

通讯单位：中国疾控中心传染病所、中科院青岛能源所单细胞中心

导读

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）是人类最常见的慢性感染细菌，它生长缓慢且培养条件苛刻，因此临床合理用药和精准溯源均面临挑战。青岛能源所与中国疾病预防控制中心传染病预防控制所（中国疾控中心传染病所）、青岛市立医院、青岛星赛生物等医产学研联合团队，依托原创的临床单细胞拉曼药敏快检系统（CAST-R），建立了单个细菌细胞精度、“鉴定-药敏-溯源”全流程一体化的H. pylori诊疗技术CAST-R-HP，具有快速病原鉴定、精确药敏表型检测、基于单细胞全基因组支撑耐药机制研究与精准溯源等优势。

摘要

背景：与幽门螺杆菌（H. pylori）感染的斗争需要快速，可靠和灵敏的病原体鉴定（ID），基于代谢反应的抗菌药敏试验（AST）以及揭示耐药机制的全基因组突变分析。

方法：我们建立了幽门螺杆菌的临床抗菌药敏试验结合拉曼图谱分析检测方法（CAST-R-HP），并对其进行临床样品的验证。该方法能够对抗性表型的病原体细胞进行快速鉴定和基于代谢抑制的AST以及高质量的全基因组测序，所有这些检测都以精确的单细胞分辨率直接从活检样品中进行。

结果：在CAST-R-HP中，单细胞拉曼光谱（SCRS）的自动采集和机器学习能够直接从活检样本中区分单个幽门螺杆菌细胞，ID的准确率为98.5±0.27%。此外，通过在获取 SCRS 之前添加 48-h D₂O 喂养和药物暴露步骤，CAST-R-HP 根据代谢抑制水平以 100% 的准确度检出左氧氟沙星和克拉霉素的 AST。此外，CAST-R-HP通过拉曼激活的重力驱动细胞封装和测序，支持使用SCRS定义的靶向药物敏感性表型对单个幽门螺杆菌细胞进行快速分选、低偏倚DNA扩增和全基因组测序。全基因组突变图谱（最大覆盖率为99.70%），精确地以单细胞分辨率，不仅阐明了药物敏感性表型，而且还揭示了它们的潜在分子机制。

结论：培养独立性、更短的周转时间、高分辨率和全面的信息输出表明，CAST-R-HP 是诊断和治疗幽门螺杆菌感染的强大工具。

主要结果与讨论

全球约半数人口感染H. pylori，70%以上的胃癌与H. pylori感染有关，根除H. pylori可显著减少胃癌发生。我国H. pylori感染呈现高感染率（约50%）、高疾病负担、高耐药率和低根除率特征，而低根除率的主要原因为H. pylori菌株耐药严重。因此，建立一个高效的药敏诊断、治疗与溯源体系，对于临床和相关疾病防控至关重要。

　　目前H. pylori耐药菌鉴定的临床金标准是内镜检查与细菌培养相结合的药敏检验。由于其生长条件苛刻，分离和培养胃活检标本中的H. pylori通常需7~10天，且难以考察临床样品中“原位”的病原多样性。在获得纯培养后开展的表型药敏实验，同样耗时很长，且技术要求高。而基于基因型的药敏检测方法仅能预测部分已知耐药基因的突变，并存在不同程度的假阴性。目前临床医生主要依赖经验用药而非药敏结果指导性下的精准治疗。但是，随着H. pylori耐药性的不断增加，经验治疗的根除失败率日益严重。

针对以上瓶颈问题，中科院青岛能源所单细胞中心和中国疾控中心传染病所、青岛市立医院合作，建立了单个细菌细胞精度的“鉴定-药敏-溯源”全流程一体化的H. pylori诊疗技术CAST-R-HP（Fig.1 CAST-R-HP工作流程）。

图1. CAST-R-HP工作流程

首先，构建了15种临床常见胃部共生菌的单细胞拉曼光谱（SCRS）参考数据库；进而利用端到端的深度卷积神经网络（DCNN），将拉曼光谱特征提取与分类模型训练过程相融合，有效提升了基于SCRS的病原鉴定准确率。直接从临床胃黏膜样品出发，对H. pylori细胞进行识别和鉴定，准确率达98.5 ± 0.27%。

图2. 基于SCRS的幽门螺杆菌病原体鉴定（临床活检标本） (A)拉曼光谱临床上细菌的种类很难区分。15个分离株的600个光谱平均值为以粗体显示；(B)使用一维残差网络共18层(详见方法)，对拉曼光谱进行分类；(C) 15个菌种的混淆矩阵。沿着对角线的项表示每个类的准确性；(D)预测和真实相对丰度的性能比较模拟样品中含有不同比例的幽门螺杆菌的谱图和14种非幽门螺杆菌的谱图。

进而，研究人员建立了单细胞精度测定代谢抑制程度的H. pylori药敏表型快检技术。与临床标准E-test法相比，17株H. pylori临床分离株对左氧氟沙星、克拉霉素的药敏检测准确率分别为94%和100%。另外，针对7例患者胃黏膜组织样本，通过48~72小时的重水饲喂和药物孵育，无需分离培养，直接测定样品中H. pylori细胞对于左氧氟沙星的药敏性，准确率为100%。

图3.单细胞精度测定代谢抑制程度的H. pylori药敏表型快检技术，无论是纯培养还是临床胃活检样本：(A) 0，1，2 mg/L左氧氟沙星对H. pylori代谢水平抑制程度，菌种选用Lev-S (h.p ylori ATCC 26695)和Lev-R (h.p ylori A105)；(B) 0、0.5、1mg /L 克拉霉素对H. pylori代谢水平抑制程度，菌种选择Clr-S (H. pylori ATCC 26695) strain和Clr-R strain (H. pylori A024)；代谢水平抑制程度阈值验证(C)和(D)。红线为测定药敏的标准。(E)临床胃活检标本的AST流程；(F)7例胃活检标本MIL截断值的验证（2 mg/L 左氧氟沙星孵育3天）。

最后，针对耐药机制研究和全基因组溯源，研究人员从临床样品中直接识别特定药敏表型的H. pylori细胞，进而通过拉曼光镊液滴单细胞分选（RAGE）芯片，完成高均衡性的目标单细胞分选和核酸扩增。拉曼分选后的单个H. pylori细胞，全基因组覆盖度可达99.7%，通过基因型验证了药敏表型。

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图4. 拉曼光镊液滴单细胞分选临床样本中抗性突变体及全基因组测序：(A) 临床胃活检标本的RAGE-Seq工作流程；(B) Y027样品的HP2和HP18细胞在左氧氟沙星作用下的SCRS显示C-D峰，表示代谢活性强（即对左氧氟沙星具有抗性，而Y030样品的HP31细胞表现出易感性）；(C) 基于全基因组测序的极大似然系统发育树和不同抗生素(Lev或Clr)的耐药模式及其遗传决定因素，测序的57个幽门螺旋杆菌基因组（即HP2、HP18和HP31，它们都是精确的基于直接从临床样本通过RAGE-Seq提取的单细胞基因组，加上其他54个纯分离培养的基因组）。抗性模式用红色表示。

总之，利用CAST-R-HP，从临床样品到药敏结果的完整流程可大幅缩短至3天，而且能在单细胞分辨率、全基因组水平完成耐药机制研究与精准溯源。下一步，研究人员将基于“微生物药敏单细胞技术临床示范网络”（SinCheckNet）”，进一步开发CAST-R-HP系统，拓展其应用，从而为建立单细胞精度的幽门螺杆菌诊疗与疾控体系奠定技术和装备基础。

通讯作者简介

徐健研究员，中国科学院青岛生物能源与过程所研究员、所务委员、生物能源研究室主任、单细胞中心主任、基因组工程团队负责人；山东省能源生物遗传资源重点实验室主任。任mSystems高级编辑。论文发表于Science、Cell Host Microbe、Nature Commu. 等140余篇，被引11600余次。获国家高端人才计划（2012；2019）、国家杰出青年基金（2014）等荣誉。主要通过单细胞分析仪器系列（单细胞拉曼分选仪、单细胞拉曼分选测序系统、单细胞拉曼耐药快检仪等）和微生物组数据科学/人工智能工具，探讨微生物组检测与修复人体与环境、以及生物资源高通量筛选的方法学。

张建中研究员，首批新世纪百千万人才工程国家级人选”，享受政府特殊津贴，中央联系专家。现任中国疾病预防控制中心传染病预防控制所副所长，传染病诊断室主任，主要承担幽门螺杆菌病原分子生物学研究（包括胃癌相关菌株研究、耐药性研究、抗菌药物研发、细菌抗原性差异及菌型分析、幽门螺杆菌疫苗研究等，承担全国幽门螺杆菌菌株库的构建和管理工作）、空肠弯曲菌病原生物学研究、支原体病原分子生物学研究、传染病诊断新技术、蛋白质组分析和芯片技术研究、以及细菌耐药机制研究等多项科研和（幽门螺杆菌感染、空肠弯曲菌感染、猩红热、金黄色葡萄球菌感染、肺炎支原体感染、鲍曼不动杆菌疾病预防控制项目相关的）传染病疾病控制工作。

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