引物设计原则

1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区5'端的300-400bp区域内，可以用DNAMAN，Alignment软件看看结果。

2、不能形成2级结构。

3、引物长度一般在17-25bp之间，上下游引物不能相差太大。

4、G+C含量在40-60%之间，45-55%最佳。

5、碱基要随机分布，尽量均匀。

6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。

7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。

8、引物5‘端可以修饰。

9、3’端不可修饰，而且要避开AT，GC富集的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。

10、引物3'端要避开密码子的第三位。

11、引物整体设计自由能分布5'端大于3‘端。

12、定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp。

Primer6.0

file→new→sequence

把自己的序列复制到这里，然后点击add

点击红蓝箭头开始设计引物

点击这里选择参数

选择好后点击seach

下面方框就会出现一个引物，可以点击all Primers

可以看到所有primers，选取其中Rating（看综合评分即黑色评分）较高，且Lenth bp中蓝红数字在10以上，30以内（最好是10-20之间），黑色数字在100-200之间（最高不超过300）的引物。9.选完以后，单机该引物一栏，待该栏变蓝色后，点Replace即可将该引物设置为最佳引物

F是正向引物，5’-3’，R是反向引物

然后用TBtools检查引物特异性

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