蛋白胶条质谱鉴定实验

如期生物

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一、简介

客户用蛋白跑SDS分离胶，切开目的条带或者跑浓缩胶切下胶条。也可以直接coIP实验所得蛋白液。我司拿到样品后，对样品进行蛋白抽提，烷基化、酶切处理，再上机检测，对蛋白进行定性分析。

二、操作过程

三、部分报告展示

四、平台优势

1、专业团队，严格按照SOP操作，真实反映样品信息

2、配备高端检测平台，使用Thermo Scientific™ Q Exactive™ 组合型四极杆 Orbitrap 质谱进行检测

3、配套商业软件，准确鉴定序列，结果可重复性高

TIC

蛋白覆盖率谱图

目标肽段二级谱图

五、常见样品类型

常见样品类型
序号	类型
1	胶条
2	蛋白液
3	磁珠
4	IP产物
5	蛋白粉末
6	多肽粉末

实验目的：通过对胶条样品进行酶切，检测胶条内含有的蛋白。

前言，SDS-PAGE为常用蛋白检测技术，蛋白通过不同分子量进行区别，对不同条带切下后进行质谱检测实验。另外可以通过跑浓缩胶，对全蛋白进行检测。相比溶液酶切，当样品中含有干扰酶切的试剂无法去除时，可优先选择跑浓缩胶，去除干扰酶切的试剂后，再进行检测。比如做完IP、COIP实验后，因为加蛋白上样缓冲液，无法直接酶切，可以优先选择胶条酶切进行蛋白鉴定。

一、胶条脱色

1、银染胶条

银染条带用30mM K3Fe(CN)6和100mM NaS2O3 1:1混合，银颜色褪去后水洗至无色；

2、考染胶条

用50mM NH4HCO3和ACN(即乙腈）1：1混合，4度翻转，吸去液体，重复这一步直至溶液和胶块无色。

二、还原烷基化及酶切

1) 取脱色后的条带于EP管中，加入50mM NH4HCO3和ACN(即乙腈）1：1混合，涡旋振荡洗1次；

2) 加100%乙腈振荡脱水至胶粒变白，吸去液体，真空干燥5min

3) 加150ul终浓度为50mMDTT溶液，淹没胶块，振荡混匀至胶块泡胀透明，放在烘箱56℃ 1h；

4) 拿出冷却至室温，吸干，快速加入150ul100mM IAA溶液,淹没胶块，暗处放置45min；

5) 25mM NH4HCO3， 50mM NH4HCO3和ACN 1：1混合， 100% ACN各洗一次，乙腈脱水至胶粒变白，真空干燥5min；

6) 配制酶反应液：0.1ug/ul酶储液以25mM NH4HCO3稀释。加入酶液的量以淹没泡胀后的胶体积为宜。稍离心，让胶块与酶液充分接触，放在4℃ 30min；

7) 待溶液被胶块充分吸收，吸去多余酶液，加25mM NH4HCO3淹没胶块再多20ul，37℃ 消化过夜；

8) 收集酶液，在原管加入100ul 30%乙腈/0.1%TFA超声15min，吸出溶液。加入100ul 60%乙腈/0.1%TFA，超声15min，并入前次溶液，合并，冻干；

三、使用ZipTip C18多肽除盐

1）抽干后的样品用30ul0.1%TFA溶解

2）用50 μl 60%ACN/0.1%TFA 润洗TIP 10次。

3）用10 μl 0.1%TFA 清洗 TIP 10次。

4）将样本吸入并排出TIP 20次，排出液体。

5）用10 μl 0.1%TFA 清洗 TIP 5次。

6）用10μl 60%ACN、0.1%TFA洗脱肽段至新的EP管，真空干燥。

7）上机检测

四、上机检测（方法不适合所有机型，仅供参考）

1操作方法

肽段用20ul溶解液（0.1%甲酸、5%乙腈）溶解，充分振荡涡旋，13500rpm，4℃离心20min，上清转移到上样管中，吸取8uL进行质谱鉴定；

2 液相色谱设置参数

3质谱设置参数

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