【MOL PLANT PATHOL】苹果MdMRLK2 通过抑制防御反应和过敏反应负向调节对V. mali的抗性

文章信息

题目：The apple FERONIA receptor-like kinase MdMRLK2 negatively regulates Valsa canker resistance by suppressing defence responses and hypersensitive reaction

刊名：MOLECULAR PLANT PATHOLOGY

作者：Yuanyuan Jing, Changhai Liu et al.

单位：Northwest A&F University

日期：12 April 2022‍

摘要

由真菌Valsa mali引起的溃疡病是中国和其他东亚国家苹果树最具破坏性的病害之一。植物激酶受体 FERONIA 参与植物细胞的生长、发育和免疫。然而，关于 FERONIA 在苹果防御V中的功能知之甚少。在本研究中，我们发现MdMRLK2在易感病苹果的枝条中被病菌高度诱导，但在抗性品种的枝条中则没有。35S：MdMRLK2苹果相对于野生型（WT）植物表现出受损的抗性。进一步分析表明，相对于野生型，35S: MdMRLK2苹果植物在V. mali感染时脱落酸 (ABA) 水平升高，水杨酸 (SA) 水平降低。MdMRLK2过表达还抑制多酚积累，并抑制感染期间苯丙氨酸解氨酶 (PAL)、β-1,3-葡聚糖酶 (GLU) 和几丁质酶 (CHT) 的活性。此外，MdMRLK2 与 MdHIR1（一种过敏诱导的反应蛋白）相互作用，并抑制 MdHIR1 介导的过敏反应 (HR)，可能是通过损害 MdHIR1 自身相互作用。总的来说，这些发现表明MdMRLK2的过表达可能通过（a）改变 ABA 和 SA 水平，（b）抑制多酚积累，（c）抑制 PAL、GLU 和 CHT 活性，以及（d）通过破坏 MdHIR1 自我相互作用来阻断 MdHIR1 介导的过敏反应。

技术路线

主要结果

3.1 MdMRLK2过表达负调控苹果对V. mali的抗性

MRLK2的表达在M. mellana的枝条中被高度诱导，但在M. yunnaensis的树枝中没有被诱导（图 1a），表明它可能在抗性中起负面作用。我们检查了MdMRLK2在V. mali易感栽培品种 Gala-3 (GL-3) 中的表达谱，发现MdMRLK2在V. mali感染的叶子和树枝中被迅速而强烈地诱导表达（图 1b，c）。为了探索MdMRLK2在苹果防御V. mali中的作用，我们生成了两个 35S：MdMRLK2转基因株系 OE-1 和 OE-2，其MdMRLK2表达水平分别增加了 15.2 倍和 19 倍（图 1d，e）。分析了野生型（WT）、OE-1 和 OE-2 苹果植物中 MdMRLK2 的蛋白质水平，清楚地表明两个 OE 系表达 MdMRLK2 并且 MdMRLK2 条带在 OE 系中强于在WT植物（图 1f）。此外，我们用V. mali接种了 WT 和 OE 系的叶子和树枝。接种三天后，OE系中的病变区域明显大于WT植物（图 1g，h）。接种后 5 天（dpi），OE 系中的树枝病变长度显着长于 WT 植物（图 1i，j）。我们还用V. mali接种了三个MdMRLK2 RNAi 苹果愈伤组织系。WT愈伤组织中的病变区域明显大于MdMRLK2 RNAi系，并且基于台盼蓝染色，WT愈伤组织显示出比MdMRLK2 RNAi系更多的细胞死亡（图S1 ）。这些结果表明MdMRLK2在V. mali抗性中起负调控作用。

3.2 MdMRLK2的过表达增加了苹果植株的ABA含量，但降低了苹果植株对V. mali感染的SA含量

接下来测量了三种在抗病性中起重要作用的激素的含量：ABA、SA 和 JA。在第 0 天，WT 和 OE 系之间的 ABA 含量没有差异，但在 3 dpi 时，35S：MdMRLK2系的叶片中 ABA 水平比 WT 植物的叶片高 50.2%（图 2a）。在树枝中，与 WT 相比，OE-1 和 OE-2 植物中的 ABA 水平分别高出 3.6 倍和 3.3 倍（图 2b）。相比之下，OE-1 和 OE-2 的叶片 SA 含量分别比 WT 植物低 18.8% 和 26.9%（图 2c），并且树枝中的 SA 含量显示出相似的趋势（图 2d）。植物抗性相关基因如PR1、PR4、PR5和PAL在 WT 植物的叶和枝中的表达水平高于 OE 系（图 S2）。35S：MdMRLK2系和 WT 植物之间的 JA 含量没有显着差异（图S3）。为验证 ABA 和 SA 在V. mali抗性中的作用，在接种V. mali前将 ABA 和 SA 喷洒在叶片上；与对照组相比，ABA 处理后的病变区域明显更大，SA 处理后的病变区域更小（图 2e）。

3.3 MdMRLK2的过表达降低了苹果植株在V. mali感染后多酚含量

植物组织中的多酚浓度是植物抗逆性的良好预测指标。因此，我们测定了 WT 和 OE 系的叶和枝中没食子酸、阿魏酸、对香豆酸和绿原酸的含量。接种V. mali后叶片和树枝中的多酚含量均增加，但 WT 中多酚含量的增加明显高于转基因品系（图 3a-h）。这一结果表明，MdMRLK2在响应马里弧菌感染时在调节多酚积累中起负调控作用。

3.4 MdMRLK2的过表达抑制苹果植株病期间的PAL、GLU和CHT活性

进行了进一步的分析以确定在接种后疾病相关酶的活性是否增加。叶的PAL 活性在 WT 植物中显着增加了 71.7%，但在 OE-1 中仅增加了 62.2%，在 OE-2 中增加了 48.6%（图 4a）。同样，WT 树枝中的 PAL 活性分别比 OE-1 和 OE-2 树枝中的高 27.8% 和 35.7%（图 4b）。叶片GLU 活性在 WT 植物中增加 2.71 倍，但在 OE-1 和 OE-2 植物中仅增加 2.0 倍（图 4c），WT 植物中的枝条 GLU 活性是 OE 系的 1.5 倍（图 4d） . 在V. mali之后，WT 植物的叶子和树枝中的 CHT 活性比 OE 系增加的程度更大感染（图 4e，f）。

3.5 MdMRLK2与MdHIR1相互作用，限制了MdHIR1介导的HR

为了探索 MdMRLK2 降低植物抗病性的分子机制，我们进行了酵母双杂交 (Y2H) 筛选，发现 MdMRLK2 靶向过敏诱导的反应蛋白 1 (MdHIR1) (图 5a )。双分子荧光互补 (BiFC) 测定证实了它们的相互作用 (图 5b )。当 MdMRLK2-cYFP 和质膜定位的水通道蛋白 MdPIP2-nYFP 共表达时，在黄色荧光蛋白 (YFP) 通道中未观察到荧光信号（图 S4）。我们还在本氏烟草中进行了荧光素酶互补测定; MdMRLK2-cLUC 和 MdHIR1-nLUC 的共表达重构了荧光素酶活性，cLUC 与 nLUC、MdMRLK2-nLUC 与 cLUC 和 MdHIR1-nLUC 与 cLUC 的表达用作阴性对照（图 5c）。共免疫沉淀测定还表明 MdMRLK2 与 MdHIR1 相互作用（图 5d）。亚细胞定位分析表明 MdHIR1 定位于质膜（图 S5）。此外，MdHIR1在叶子和树枝中的相对表达被证明对V. mali感染有反应（图 6a，b）。

我们假设 MdMRLK2 与 MdHIR1 的结合可能会干扰 MdHIR1 介导的 HR。为了验证这一假设，我们在本氏烟草和苹果叶中共同表达 35S：GFP（绿色荧光蛋白）和 35S：MdHIR1-GFP和 35S：MdMRLK2-GFP和 35S：MdHIR1-GFP 。有趣的是，35S: MdMRLK2-GFP与 35S: MdHIR1-GFP的共表达限制了 MdHIR1 介导的过敏反应，并且在本氏烟和苹果（图 6c、d和7a）中共表达 35S: MdMRLK2-GFP和 35S: MdHIR1-GFP比在两个N中共同表达 35S：GFP和 35S：MdHIR1-GFP（叶子的左侧）的叶子中 HR 区域明显更小（叶子的右侧）。然后我们测量了过表达 MdHIR1的本氏烟和苹果叶中活性氧 (ROS) 的积累。正如我们预期的那样，MdHIR1诱导的 ROS 积累在共表达 35S：MdMRLK2-GFP和 35S：MdHIR1-GFP（叶右侧）的叶子中比在共表达 35S：GFP和 35S：MdHIR1的叶子中低得多（图 6e和7b，c）。此外，台盼蓝染色显示，表达 35S: MdMRLK2-GFP 和 35S: MdHIR1-GFP 的本氏烟叶比表达 35S: MdHIR1-GFP和 35S: GFP的叶细胞死亡少（图 6f）。为了测试MdHIR1在苹果与病原菌相互作用期间的功能，我们在苹果叶上接种了病原菌，它们共同表达 35S：GFP与 35S：MdHIR1 -GFP和 35S：MdMRLK2-GFP与 35S：MdHIR1-GFP。共表达 35S：MdMRLK2-GFP 和 35S：MdHIR1-GFP 的叶片区域比共表达35S：GFP和 35S：MdHIR1-GFP的叶片区域具有更大的病变（图 7d）。总之，这些结果表明MdHIR1正向调节植物对病原菌抗性。MdMRLK2 和 MdHIR1 之间的相互作用限制了 MdHIR1 介导的 HR，并分别降低了在本氏烟草和苹果的叶子中对病原菌的抗性。

结论

我们发现MdMRLK2过表达通过抑制 HR ，改变激素和多酚水平降低了苹果的溃疡病抗性（图 9）。激素和多酚水平在植物抗性中起重要作用。在接种V.mali之后，与 WT 相比，过表达MdMRLK2的苹果植物具有更高的 ABA 和更低的 SA 水平，减少了多酚的积累，以及更低的 PAL、GLU 和 CHT 活性。MdMRLK2 和 MdHIR1 之间存在直接相互作用。此外，MdMRLK2 损害了 MdHIR1 的自我相互作用并限制了 MdHIR1 介导的 HR。总体而言，我们的研究结果揭示了苹果 FERONIA 受体激酶 MdMRLK2 在防御苹果溃疡病方面的新功能。

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原文链接：

https://bsppjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/mpp.13218

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