题目：Characterization of diazotrophic root endophytes in Chinese silvergrass (Miscanthus sinensis)

发表杂志：Microbiome

发表时间：2022年11月3日

通讯作者：孙蔚旻

第一作者：李永斌；杨瑞

通讯单位：广东省科学院生态环境与土壤研究所

影响因子：16.84

DOI：10.1186/s40168-022-01379-9

原文链接：https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-022-01379-9

- 成果简介 -

近日，广东省生态环境与土壤研究所孙蔚旻研究团队在国际生物领域著名期刊Microbiome上发表了题为“Characterization of diazotrophic root endophytes in Chinese silvergrass (Miscanthus sinensis)”的论文。研究利用高通量测序、DNA-SIP、宏基因组分箱、纯菌分离培养和盆栽实验证明尾矿生长的先锋植物芒草可以特异性地招募一些固氮内生菌，提高其对极端环境的生态适应性。

- 主要结果 -

①先锋植物根内生菌群落及关键微生物分析

对尾矿库（HC）和周边低污染产地（LC）采集先锋植物进行分析。微生物多样性分析表明，与LC相比，HC样品根内微生物的alpha多样性（如Chao1、Observed和Shannon）较低。同时因场地的不同导致细菌群落组成有显著差异。在微生物的属水平上分析表明，根瘤菌属（Rhizobium）是HC中优势属，厌氧菌属（Anaeromyxobacter）是LC中优势属，根据关键微生物网络图分析，结果表明微生物存在显著差异。

图1 先锋植物根内生菌群落及关键微生物分析

A: alpha多样性分析；B: beta多样性分析；C: 微生物属水平差异；D、E、F、G: 关键微生物网络分析

② DNA-SIP鉴定先锋植物根内生固氮菌

用无氮的Jensen培养基构建SIP微宇宙培养体系。经过超高速离心后，检测各分层（fraction）中的nifH基因丰度，发现培养第28天后，¹⁵N₂处理中nifH基因丰度最高层向重层（heavy fractions）发生了明显偏移，说明内生菌已将大量的¹⁵N同化。基于上述SIP分层结果，对培养28和35天的¹⁵N₂处理的重层及¹⁴N₂处理的轻层（light fractions）进行16S rRNA基因高通量测序，Exiguobacterium、Pseudomonas和Rhizobium在¹⁵N₂标记处理的重层DNA部分中占主导地位，这可能是潜在的固氮内生菌。

图2 DNA-SIP鉴定先锋植物根内生固氮菌

A: 微宇宙培养21、28和35天后，¹⁴N₂和¹⁵N₂处理的CsCl梯度中nifH基因的相对丰度。分析了整个梯度分层中，每个分层中的nifH基因的丰度都转换为总的nifH基因拷贝数的相对丰度；B: SIP实验中，¹⁵N₂处理的重层及¹⁴N₂处理的轻层中微生物群落组成的比较

③ 固氮内生微生物的代谢途径

为进一步研究先锋植物固氮内生功能微生物的相关代谢途径，对¹⁵N₂处理的重层DNA进行宏基因组测序分析。利用宏基因组分箱技术拼接基因组草图，得到了4个高质量基因组草图，系统发育树将其分类为Exiguobacterium、Pseudomonas、Rhizobium和Microbacterium。其中bin1、bin2和bin3是DNA-SIP实验鉴定活性内生固氮菌。在这三个MAGs中都发现了固氮酶基因，以及与植物定殖、重金属抗性和植物促生相关的基因。

图3 固氮内生微生物的代谢途径

A: 固氮内生菌基因组草图和B: 功能基因分析

④ 内生固氮菌的分离及其植物促生能力的验证

从芭芒根内分离出两株固氮内生菌，分别是Pseudomonas sp. Y-5和Rhizobium sp. G-14。对分离筛选出的菌株进一步进行盆栽实验，验证了其植物促生能力。接菌处理组相比对照显著提高了植物茎的鲜重。此外，显著增加根/茎氮含量。为验证生物固氮，进一步对鬼针草茎和根中转录的nifH基因进行了定量，相比对照组接种显著增加了植物根和茎的转录nifH基因的拷贝量。

图4 内生固氮菌的分离及其植物促生能力的验证

A: 不同处理的鬼针草幼苗图片；B: 接种分离菌株对鲜重；C: 根和茎氮含量；D: ¹⁵N丰度的影响；E: 根和茎中nifH转录水平在不同处理之间的比较

⑤ 分离内的生固氮菌对植物的定殖效果

为验证分离得到的内生固氮菌的定殖效果，对根际和根内的微生物群落特征进行了研究。结果表明接种处理显著增加了接种固氮菌在根际和根内的丰度。qPCR试验进一步证实了处理组相比对照显著增加了根际和根内Pseudomonas和Rhizobium的丰度。

图5 盆栽根际和根内微生物群落组成

- 第一作者-

广东省科学院

生态环境与土壤研究所

李永斌

博士后

第一作者：李永斌，2020年毕业于中国农业大学，现在广东省科学院生态环境与土壤研究所从事博士后研究。主要研究方向为重（类）金属微生物的代谢机制、植物促生功能菌的挖掘、微生物菌剂的研发及推广应用。近5年，以第一作者/通讯作者发表SCI论文17篇，主要刊登于Microbiome、Environmental Science & Technology、Environment International、Journal of Hazardous Materials等国际权威期刊上；主持国家自然青年基金、博士后面上项目；获得2019年度大北农科技奖（排名第2）；授权发明专利3项。

河南科技大学

广东省科学院

生态环境与土壤研究所

杨瑞

研究生

共同一作：杨瑞，河南科技大学和广东省科学院生态环境与土壤研究所联合培养在读研究生。

- 通讯作者 -

广东省科学院

生态环境与土壤研究所

孙蔚旻

研究员

博士生导师

孙蔚旻，博士、研究员、博士生导师。研究方向是元素耦联循环与污染控制。曾获中组部十三批海外高层次人才，广东省珠江人才计划青年拔尖人才，2012年毕业于密西根州立大学环境工程系，新泽西罗格斯大学博士后。

主要围绕环境组学、DNA-SIP技术、重（类）金属与有机污染物的微生物代谢机制等方面开展了大量研究，相关成果已发表高水平SCI论文120余篇，主要收录在The ISME Journal, Environmental Science & Technology、Geochimica et Cosmochimica Acta、Water Research、Microbiome、Environmental Microbiology、Environment International和Applied and Environmental Microbiology等环境科学权威期刊。主持国家自然科学基金联合基金重点支持项目，国家自然科学基金国际（地区）组织合作交流项目，面上项目等国家级项目。

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