CRISPR-Cas9实验常见问题及解决方案

做一件事的解决方案有很多种，不同的方案会有不同的protocol，那又回到源头问题，到底要选择什么方案？遇到问题的时候到底如何解决？

CRISPR-Cas9基因编辑最常遇到的问题就是：没挑到单克隆、编辑不成功/效率。相信包括我在内的很多CRISPR新手，会将更多的重点放在sgRNA的设计、感染/转染、挑单克隆等等方面，一直到最后基因敲除效率还是很低或者根本没成功。
会首先将原因归结在sgRNA的效率不高，因此会选择重来一次。
同时CRISPR-Cas9的名字也非常具有迷惑性，会让我们潜意识的放在CRISPR-Cas9这两个元件上。
然而，CRISPR-Cas9只是前半部分，后半部分则是DNA repair。
这意味着，即使sgRNA效率非常高，一切都很完美，但如果DNA repair出来岔子，一样前功尽弃。
因此，不要忘了DNA repair在基因编辑中的重要作用。
我们在实验设计阶段就要充分考虑课题目的，选择相应的DNA修复方式。

从文献中我们可以看到，在外界损伤的刺激下，例如细胞内活性氧、电离辐射、紫外损伤以及药物干预等等, 细胞能启动 7 条修复通路来分别应对不同类型的损伤：

（1）直接修复 (direct repair, DR) 通路;
（2）碱基切除修复 (base excision repair, BER);
（3）核苷酸切除修复 (nucleotide excision repair, NER);
（4）碱基错配修复 (mismatch repair, MMR) 纠正碱基错配;
（5）同源重组修复 (homologous repair, HR);
（6）非同源的末端连接 (non-homologous end-joining, NHEJ) 通路；
（7）translesion DNA 合成 (translesion DNA synthesis, TLS)；

其中后HR，NHEJ通路专门修复 DNA 双链断裂 (DSBs)。

而CRISPR-Cas9的前期原理即是诱导DNA的双键断裂（DSBs），随后依赖DNA修复完成基因编辑工作。
虽然NHEJ和HDR仍然是CRISPR中用于基因修复的主流，但最近微同源末端连接（microhomology-mediated end-joining，MMEJ）的方法也不断活跃在视野中。
这三种DNA修复方式的简略图解如下：

3. CRISPR-Cas9中的DSB修复方式

3.1 NHEJ

非同源末端连接（NHEJ）或经典的非同源末端连接（C-NHEJ）是大多数真核生物修复DSB的主要细胞修复途径。
它发生在细胞周期的所有阶段，通常被认为是一种快速修复机制（大约10分钟）。
从最基本的意义上说，这种机制的工作原理是通过微小的处理将DNA的钝端重新连接在一起。
具体步骤如下：

（1）DSBs形成后，p-γH2AX，ATM套在DSBs两端，同时Ku70/80按顺序套上，接着是DNA-PKcs套上，形成一个连环套，并经由DNA-PKcs将DSBs钝端拉近，并出现Artemis蛋白卡住DSBs两端：

（2）之后在多种酶的作用下，DNA修复如初。

NHEJ具有以下特点：

（1）NHEJ介导DSBs修复常常会造成插入缺失错误（indels errors），因此在经常会达成一个双敲（null, knockout）的效果。NHEJ在修复过程中产生的Indels errors通常很小(1-10 bp)，但差异极大，因此产生移码突变的几率约为2/3。
（2）NHEJ介导的DSBs修复不一定会引入indels，但Cas9引起的无核苷酸损伤的DSBs仅为5%左右；即使NHEJ修复后没有引入indels，这样的精确修复的目的区域还会再次被Cas9切开，而indels产物则不会。由于单个细胞的分裂和DNA修复周期所需的时间在1小时以内，因此Cas9引入DSBs再经NHEJ修复的过程会不断循环重复，结果是在一天之内大部分染色体上都会被引入indels。由此可见依赖于NHEJ修复方式的CRISPR-Cas9是既快速且效率又高。而我们前面的系列protocol则选用了这一方法。
（3）需要注意的是，Cas9在造成DSBs之后可能不会立刻从DNA上脱落，这也会阻碍DNA的NHEJ修复。
（4）NHEJ结合上成对的sgRNA，也可以达到整段敲除的效果。
（5）NHEJ在整个细胞周期中都是活跃的，其活性从G1期到G2/M递增，即：G1 < S < G2/M。

3.2 HDR

如果说NHEJ是易出错的DNA修复方式，我们利用了NHEJ易出错的特性，从而引入indels。而在更多的时候，我们希望能够达到精准修复的结果，例如镰状红血球贫血症（Sickle-cell anemia, SCA）等疾病已经明确病因为相关基因突变，如能使用基因编辑技术，精准编辑改变突变位点可达到釜底抽薪的治疗效果。
目前由CRISPR Therapeutics 公司研发的用于治疗β地中海贫血的CRISPR/Cas9疗法 CTX001已经进入临床试验阶段。
这种精准编辑也依赖DNA repair的精准修复，即同源重组修复（homologous repair, HR；Homology Directed Repair，HDR）。

HDR是真核生物中第二常见的DSB修复机制（除了以HDR为主的芽殖酵母）。与NHEJ不同，HDR依靠同源的修复模板（通常是姐妹染色单体）来修复断裂的DNA。
HDR在S晚期和G2期是活跃的。可以利用HDR机制进行CRISPR-Cas9介导的基因编辑，方法是引入一个外源性DNA模板，该模板包含目的基因的同源序列。
以下图解简单介绍经HDR方式，以CRISPR-Cas9方法精准在基因组中插入序列的步骤。

HDR具有以下特点：

（1）HDR要求模板具有足够长的同源臂序列；
（2）HDR活跃于S晚期和G2期；
（3）在设计修复模板时需要注意，ssDNA模板（简称ssODNs）通常用于较小的基因修改，小的插入/编辑可能只需要30-50 bp同源臂，但这个长度并不是绝对，通常使用50-80 bp同源臂；

3.3 MMEJ

微同源末端连接（microhomology-mediated end-joining，MMEJ）与NHEJ和HDR相比，MMEJ并没有受到太多的关注。

MMEJ具有以下特点
（1）所需同源臂较短，5-25 bp;
（2）MMEJ在M期和S早期比较活跃；

三种DSB修复方式对比
（1）MMEJ不能像HDR那样完美的精准修复，但它却比NHEJ更容易预测，DSB两侧的短同源区域（5-25 bp）可以定位到基因编辑的目标DNA序列，即精准度：HDR > MMEJ > NHEJ。
（2）但对于没有良好HDR系统的物种，即使存在修复模板，其修复方式仍然是NHEJ；
（3）HDR的同源性越长，重组效率越高，但同源臂越长，克隆时间就越长。相比之下，MMEJ的短同源序列较易通过PCR扩增得到。效率和简单程度：NHEJ > MMEJ > HDR；
（4）NHEJ虽然效率高，但是易出错；HDR精准度最高但是效率却最低；因此在MMEJ活性允许的情况下，也可以达到敲入、替代或删除核苷酸的效果，但效率低于NHEJ；

4. 细胞周期的对DNA repair的影响

在上文中不断提到不同DNA修复方式在细胞周期中的活跃时间段，例如NHEJ在全周期活跃，并且随着细胞周期的推荐活性更强；HDR则活跃于S末期和G2期，MMEJ则互补性的在M期和S早期活跃。
尤其可见细胞周期的变化也会影响基因编辑的效率。
例如在2018年Nature Medicine的文章CRISPR–Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response中提到，
（1）在常规敲除人视网膜色素上皮细胞（RPE1)中，Cas9诱导的DSBs激活了TP53基因，而TP53基因的激活使得细胞停留在G1期，因此NHEJ活性上调而HDR活性下调（如下图所示）；
（2）而敲除TP53基因后，由于TP53激活导致的G1周期停滞被废除，使得细胞周期继续保持正常运行，因此HDR的活性得以保持。
最终的结论是TP53的缺失会促进HDR介导的CRISPR-Cas9，原因则是细胞周期影响。图示如下：

本文试图通过比较不同DSB修复方式的机制以及特点，希望能加深我对CRISPR-Cas9的理解，并进一步了解CIRSPR-Cas9方案设计以及实验失败需要debug时所需要考虑的问题。

当然，如果大家还有问题可以在接下来的2021年3月2日的直播间来一起讨论哦！