【CRISPR-Cas9神助攻】 Cas9稳定表达细胞系、CRISPR/Cas9敲除细胞系

CRISPR/Cas9基因敲除系统由有DNA切割活性Cas9蛋白及识别特异靶点的gRNA组成，由于只需对系统中的gRNA进行编辑就能实现靶点识别，极大了简化了构建基因敲除载体的工作。

CRISPR-Cas9 赋予我们精准编辑基因的能力

在 Google 学术上，CRISPR Cas9 相关的文献已经超过 51700 篇。

为何使用s9的稳定表达细胞系

在哺乳动物细胞培养系统中，大多数基因组编辑都是通过瞬时转染或慢病毒转导来完成的，这对于常规的低通量应用来说是很有效的。

图 1. CRISPR/Cas9介导的基因组编辑原理图

然而，对于其他的应用，能够稳定表达其中一个组成部分，即CRISPR-Cas9核酸酶，会更加有效。

cas9 稳定细胞系应用

1)sgRNA功能验证;

2)使用慢病毒CRISPR进行基因敲除;

3)sgRNA文库筛选;

4)可诱导的基因组编辑。

应用1:sgRNA功能验证

单个sgRNAs本身的效率存在差异。在进行大量的筛选工作之前，需要确定哪些CRISPR sgRNAs能够更加高效的进行基因组编辑。

、

图 2. 通过IndelCheck™体系对 CRISPR sgRNAs功能验证实验流程。

收集经 CRISPR 或 TALEN 转染的细胞，并针对靶点序列设计引物，使用靶点 PCR 试剂盒（1）扩增经过 CRISPR/TALEN 扩增的靶点序列。所得的 PCR 产物经解链退火生成杂交 DNA 双链产物，其中部分部分可能存在错配，可以被 T7 核酸内切酶 I 试剂盒（2）酶切检出。如果 CRISPR/TALEN 对基因组的编辑功能是阳性的，错配酶切所产生的条带可以通过电泳跑胶观察到。

应用2:使用慢病毒CRISPR进行基因敲除

利用慢病毒介导CRISPR方法：

（1）一个慢病毒表达Cas9和sgRNA

（2）转导两种不同的慢病毒，一种表达Cas9，另一种表达sgRNA。

由于Cas9 ORF的体积较大(>4.4 kb)，“all in one”或“Cas9-only”慢病毒的滴度明显低于sgRNA-only慢病毒。

因此，GeneCopoeia建议，将表达cas9的稳定细胞系与表达sgRNA的慢病毒转导进而实现高效的基因组编辑。

应用3：sgRNA文库筛选

CRISPR sgRNA文库广泛应用于药物靶向识别和验证、表型变化和报告分析。CRISPR会对遗传密码进行永久性更改。因此，CRISPR可以完全敲除一个基因的所有等位基因，无论它们的转录产物是定位于细胞核还是细胞质。

图 3. 使用 sgRNA 文库进行药物靶标研究的应用示例。上：96孔板培养能稳定表达Cas9核酸酶的细胞系。中：使用 sgRNAs 文库（独立克隆文库或混合文库）对板上的 GeneHero™ Cas9 稳定表达细胞系进行转染或转导。下：对转染后的96孔板进行针对细胞死亡的筛选（图为黑孔）。每个sgRNA都带有barcode序列，因此相关的单个或多个sgRNA能被识别出来，列作药物靶标的候选。

应用4:可诱导的基因组编辑

诱导型CRISPR (iCRISPR)最早由Gonzalez等人(2014)证明，他构建了一个诱导多能干细胞(iPSC)模型细胞株，该细胞株携带Cas9，添加四环素诱导后才可以表达Cas9。文献如下：

Gonzalez, et al. (2014). An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell 15, 215.Qiu, et al. (2004). Mutation detection using Surveyor™ nuclease. Biotechniques 36, 702.

所以

这么有用的cas9稳转株

哪里来？

* 70+ 种人类、小鼠、大鼠CRISPR-Cas9 稳定表达细胞系；

* 涵盖26+ 种不同癌症，如：肺癌、宫颈癌、乳腺癌、肝癌等细胞系。

* 通过safe harbor位点整合，确保 Cas9 稳定表达，同时对细胞无副作用。

* 可配合 sgRNA 克隆、sgRNA文库以及供体克隆服务使用。

产品描述	单位	包装量
Cas9阳性人淋巴瘤细胞系Raji	支	1.00E+06
Cas9阳性人红白血病细胞系K562	支	1.00E+06
Cas9阳性人肺癌细胞系A549	支	1.00E+06
Cas9阳性人肝癌细胞系Hep G2	支	1.00E+06
Cas9阳性人非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299	支	1.00E+06
Cas9阳性人大细胞肺癌细胞系NCI-H460	支	1.00E+06
Cas9阳性人大细胞肺癌细胞系NCI-H661	支	1.00E+06
Cas9阳性人肺癌细胞系A-427	支	1.00E+06
Cas9阳性人肝癌细胞系Hep 3B2.1-7	支	1.00E+06
Cas9阳性人宫颈癌细胞系HeLa	支	1.00E+06
Cas9阳性人宫颈癌细胞系SiHa	支	1.00E+06
Cas9阳性人骨肉瘤细胞系MG-63	支	1.00E+06
Cas9阳性人成骨肉瘤细胞系Saos-2	支	1.00E+06
Cas9阳性人成骨肉瘤细胞系U-2 OS	支	1.00E+06
Cas9阳性人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y	支	1.00E+06
Cas9阳性人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞系RD	支	1.00E+06
Cas9阳性小鼠成肌细胞系C2C12	支	1.00E+06
Cas9阳性人结直肠癌细胞系HCT 116	支	1.00E+06
Cas9阳性人结肠腺癌肺转移细胞系T84	支	1.00E+06
Cas9阳性人结直肠腺癌细胞系Caco-2	支	1.00E+06
Cas9阳性人结肠癌细胞系COLO 205	支	1.00E+06
Cas9阳性人结直肠腺癌上皮细胞系DLD-1	支	1.00E+06
Cas9阳性人结肠癌细胞系HT-29	支	1.00E+06
Cas9阳性人结肠癌细胞系SW480	支	1.00E+06
Cas9阳性人结肠腺癌细胞系LS 174T	支	1.00E+06
Cas9阳性人结肠癌细胞系RKO	支	1.00E+06
Cas9阳性人纤维肉瘤细胞系HT-1080	支	1.00E+06
Cas9阳性小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系RAW 264.7	支	1.00E+06
Cas9阳性人B淋巴细胞瘤细胞系Ramos	支	1.00E+06
Cas9阳性人套细胞淋巴瘤细胞系Mino	支	1.00E+06
Cas9阳性人套细胞淋巴瘤细胞系JeKo-1	支	1.00E+06
Cas9阳性人套细胞淋巴瘤细胞系REC1	支	1.00E+06
Cas9阳性人B细胞淋巴瘤细胞系SU-DHL-6	支	1.00E+06
Cas9阳性人组织淋巴瘤细胞系U-937	支	1.00E+06
Cas9阳性人卵巢癌细胞系SK-OV-3	支	1.00E+06
Cas9阳性人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH	支	1.00E+06
Cas9阳性人神经胶质瘤细胞系U-87 MG	支	1.00E+06
Cas9阳性人脑胶质瘤细胞系T98G	支	1.00E+06
Cas9阳性人恶性黑色素瘤细胞系A-375	支	1.00E+06
Cas9阳性人皮肤鳞癌细胞系A-431	支	1.00E+06
Cas9阳性人皮肤成纤维细胞Hs 865.Sk	支	1.00E+06
Cas9阳性人前列腺癌细胞系DU 145	支	1.00E+06
Cas9阳性人前列腺癌细胞系LNCaP clone FGC	支	1.00E+06
Cas9阳性人前列腺癌细胞系PC-3	支	1.00E+06
Cas9阳性人乳腺癌细胞系MCF7	支	1.00E+06
Cas9阳性人乳腺癌细胞系MDA-MB-468	支	1.00E+06
Cas9阳性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231	支	1.00E+06
Cas9阳性人正常乳腺上皮细胞系MCF 10A	支	1.00E+06
Cas9阳性人乳腺腺癌细胞系SK-BR-3	支	1.00E+06
Cas9阳性人乳腺导管癌细胞系T-47D	支	1.00E+06
Cas9阳性大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC-12	支	1.00E+06
Cas9阳性人急性淋巴细胞白血病细胞系CCRF-CEM	支	1.00E+06
Cas9阳性人Burkitt's淋巴瘤细胞系Daudi	支	1.00E+06
Cas9阳性人急性早幼粒细胞白血病细胞系HL-60	支	1.00E+06
Cas9阳性人急性淋巴细胞白血病细胞系MOLT-4	支	1.00E+06
Cas9阳性人急性单核细胞白血病THP-1	支	1.00E+06
Cas9阳性人套细胞淋巴瘤细胞系JVM2	支	1.00E+06
Cas9阳性人胃腺癌细胞系AGS	支	1.00E+06
Cas9阳性人胃癌细胞系SNU-16	支	1.00E+06
Cas9阳性人胰腺癌细胞系PANC-1	支	1.00E+06
Cas9阳性大鼠胰岛β细胞肿瘤细胞系RIN-5F	支	1.00E+06
Cas9阳性人宫颈癌细胞系HeLa S3	支	1.00E+06

高分文献举例

Combinatorial CRISPR-Cas9 Metabolic Screens Reveal Critical Redox Control Points Dependent on the KEAP1-NRF2 Regulatory Axis. 2018. Molecular Cell, IF 17.819. A549 and HeLa Cas9--expressing stable cell lines.

Dissection and function of autoimmunityassociated TNFAIP3 (A20) gene enhancers in humanized mouse models. 2018. Nature Communications, IF 12.124. 293T Cas9-expressing stable cell line.

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