甲基化系列 1. 甲基化之前世今生（Methylation）

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公司英文名称：Kyoho Gene Technology (Beijing) Co.,Ltd.

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最近刚好有点小业务做甲基化，甲基化对于我来说再熟悉不过了，因为生信入行就一直做甲基化，从植物做到动物，又从动物做到癌症，甲基化不同类型，DNA甲基化，RNA甲基化，以及组蛋白甲基化都非常熟悉，这里就先从胞嘧啶甲基化（5mC）说起，因为好多老师问GEO/TCGA的270K, 450K, 850K的数据都怎么分析，今天开始连载几篇表观遗传学相关数据的处理以及后续SCI文章内容该怎么分析等！！

表观遗传学

表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化（DNA methylation），基因组印记（genomic imprinting），母体效应（maternal effects），基因沉默（gene silencing），核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑（RNA editing）等。所以说表观的修饰只是改变基因的表达而不改变基因本身。

表观遗传改变主要从四个层面调控基因表达
（1）DNA甲基化：DNA共价结合甲基基团，使相同序列等位基因处于不同修饰状态；
（2）组蛋白修饰：通过对结合DNA的组蛋白进行不同的化学修饰实现对基因表达的调控；
（3）染色质重塑：通过改变染色质的空间构象实现对基因表达的调控；
（4）非编码RNA的调控：RNA可通过某些机制实现对基因转录和转录后的调控。

举个例子：同卵双生的双胞胎个体，从遗传学角度说他们的DNA序列是一致的，但多种表型存在一些差异。经典的孟德尔遗传定律和生物学表型之间还存在另外一层调控因素，即表观遗传。

**DNA甲基化
**

DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

DNA甲基化是最早被发现、也是研究最深入的表观遗传调控机制之一。广义上的DNA甲基化是指DNA序列上特定的碱基在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化作用下，以S—腺苷甲硫氨酸（S—adenosyl methionine，SAM）作为甲基供体，通过共价键结合的方式获得一个甲基基团的化学修饰过程。这种DNA甲基化修饰可以发生在胞嘧啶的C—5位、腺嘌呤的N—6位及鸟嘌呤的G—7位等位点。一般研究中所涉及的DNA甲基化主要是指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，其产物称为5—甲基胞嘧啶（5—mC），是植物、动物等真核生物DNA甲基化的主要形式，也是发现的哺乳动物DNA甲基化的唯一形式。DNA甲基化作为一种相对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制。

基因组中DNA的甲基化模式是通过DNA甲基转移酶实现的。DNA甲基化酶分为2类，即维持DNA甲基化转移酶（Dnmtl或维持甲基化酶）和从头甲基化酶。根据序列的同源性和功能，真核生物DNA甲基化转移酶又分为4类：Dnmtl/METl、Dnmt2、CMTs和Dn-mt3。DnmtliiMETl类酶参与CG序列甲基化的维持。CMTs类酶仅发现在植物中，主要特征是它的催化区T和Ⅳ包埋染色体的主区，并且特异性地维持CG序列的甲基化。Dnmt:3类酶在小鼠、人类和斑马鱼中得到鉴定．Dnmt3a和Dnmt3b在未分化的胚胎干细胞中高度表达，但在体细胞中表达水平很低。它们的主要作用是从头甲基化，但对维持甲基化也起到一定的作用，并且负责重复序列的甲基化。

CpG甲基化
C位点的甲基化主要发生在CpG序列上。
CpG二核苷酸中的C常常被甲基化。在哺乳动物中CpG以两种形式存在：一种是分散于DNA序列；另一种呈现高度聚集，为CpG岛。在正常组织里，70%~90%分散的CpG是被甲基修饰（对维持基因族的稳定性具有重要作用），而位于基因转录调控区域CpG岛中的CpG则往往是非甲基化的（有利于转录因子和转录调控区域结合，影响下游结构基因的转录）。

CpG岛常常位于基因启动子区域
以下面这个基因为例，红色竖线代表CpG位点，下面是APRT这个基因的第一外显子和第二外显子，可以看到CpG位点集中于启动子区域，第一外显子和第一内含子区域。

启动子区域CpG位点甲基化影响基因转录
以下图为例，黄色部分是CpG位点中的C位点，当其为非甲基化时，转录因子和辅助转录蛋白可以顺利地结合在转录的其实区域，从而推动下游基因的转录。
然而，当C被甲基化之后，空间结构发生了变化，转录因子和辅助转录蛋白不能结合在转录其实区域，最终造成基因转录的抑制。因此，甲基化常常通过基因的转录来调控基因的表达。

肿瘤细胞中CpG位点甲基化变化
以肿瘤细胞中CpG位点甲基化变化为例，上一张图是正常细胞，左边是肿瘤抑制基因，右边是分散的CpG位点，在正常细胞的肿瘤抑制基因中，CpG位点通常是非甲基化的，因此这些基因是可以表达的。在分散的CpG位点当中常常是甲基化的。
在下方的肿瘤细胞当中，肿瘤抑制基因CpG位点中的C常常是甲基化的，造成该基因表达沉默，但分散CpG位点中的C常常是非甲基化的。
因此，这样造成抑癌基因表达缺失，同时造成整个基因组的不稳定。

甲基化检测方法

随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法应运而生。DNA甲基化的检测方法包括甲基化特异性PCR(MS-PCR)、亚硫酸氢盐处理+测序、联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)、荧光定量法、芯片技术和高通量测序等等。基于芯片和测序的甲基化检测方法为大量甲基化位点检测方法的主流。

**基于芯片的甲基化检测方法
**

DNA 甲基化作为重要的表观遗传学的标记，能够调控基因的表达，在生长发育和疾病相关研究领域都有着重要意义。测定甲基化的手段有很多，芯片作为一种成熟的手段，其稳定性，可重复性以及性价比，使得在DNA甲基化研究领域芯片占据了半壁江山。

对于human 来说，目前主流的DNA甲基化芯片有450K 和 850K 两种，都是illumina 公司研发的。这里的 450K 和 850K 指的是芯片上探针的数量，对应可以检测的甲基化位点个数。

在GEO 数据库中，每种芯片都有对应的GPL 编号， 450K 芯片的链接如下：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL13534

850K 芯片的链接如下：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL21145

打开上面的链接，可以看到对应芯片的详细信息，我们来看下每种芯片探针的数量

1. 450K 芯片的探针数量：Total number of rows: 485,577

2. 850K 芯片的探针数量：Total number of rows: 868,564

从具体的探针数目也可以看出， 450K 和 850K 是1个约数，用来表明探针的数量，覆盖的甲基化位点的个数。

探针是以甲基化位点为单位的，每个探针对应检测一个甲基化位点。为了能够区分甲基化位点和非甲基化位点，在450K 和 850K中，有两种类型的探针，分别叫做I 型探针和 II 型探针。示意图如下：

亚硫酸氢盐处理的DNA ，非甲基化的C会变成T , 而甲基化的C不会变。

对于I 型探针而言，有两种序列，专业名词叫做bead type，其中Unmethylated bead type 用来和非甲基化的C杂交，Methylated bead type 用来和甲基化的C杂交。可以看到两种bead type 只有末端最后1个碱基不同，A 碱基用来杂交非甲基化的C, G碱基用来杂交甲基化的C。

ID    cg00050873
AlleleA_ProbeSeq    ACAAAAAAACAACACACAACTATAATAATTTTTAAAATAAATAAACCCCA
AlleleB_ProbeSeq    ACGAAAAAACAACGCACAACTATAATAATTTTTAAAATAAATAAACCCCG

对于II 型探针而言，设计得比较巧妙，它只需要1个bead type, 探针只涉及到甲基化位点的前一个碱基，在DNA 链的延伸阶段，根据延伸的碱基是A 还是 G , 从而判断是甲基化的C 还是非甲基化的C。下面是450K 上一个II 型探针的示例：

ID    cg00035864
AlleleA_ProbeSeq    AAAACACTAACAATCTTATCCACATAAACCCTTAAATTTATCTCAAATT

下期介绍GEO/TCGA数据读取与处理，敬请期待！

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