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导读

从细菌到人类细胞，铜离子是必需的微量元素之一，作为机体多种代谢酶的辅助因子在新陈代谢过程中发挥着重要作用。正常生理状态下，机体通过精准的代谢调控将细胞内的铜离子维持在相对稳定的水平。但当其浓度超过一定阈值时，就会对机体产生毒害作用，严重时甚至诱发细胞死亡。尽管其他必需金属（如铁）的死亡机制已经确立（➤详情请点击往期推文：和铁死亡特色研究工具集合及），但是过量的铜离子如何诱导细胞死亡的机制尚不明确。

最近，美国Broad研究所Todd R. Golub研究组与Peter Tsvetkov（第一作者）合作在国际顶级期刊Science发表题为Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins文章，发现了细胞体内依赖于铜离子且受到调控的新的细胞死亡方式：铜死亡（Cuproptosis），过量的铜离子引发三羧酸循环途径中的代谢紊乱，导致蛋白硫辛酰化水平异常以及铁硫簇蛋白的丢失，从而导致蛋白质毒性应激反应并最终导致细胞死亡。

铜离子载体诱导细胞死亡

研究者以强效铜离子载体 elesclomol 为研究对象，细胞培养基中铜的来源是血清，因此，在没有血清的情况下elesclomol对生长的细胞没有影响。相比之下，通过 1:1 的比例添加铜，细胞的生长则受到极大的抑制。此外，铜的加入同样使细胞对六种结构不同的铜离子载体变得敏感，但补充其他金属，包括铁、钴、锌和镍，未能增强细胞死亡。与这一观察结果一致，随着内源性铜螯合剂谷胱甘肽的消耗，研究者使用铜螯合剂TTM联合elesclomol处理细胞，则细胞生长不受影响；而使用其他金属离子螯合剂时，依旧会诱导细胞的死亡。这些结果表明铜离子载体诱导的细胞死亡主要依赖于细胞内铜的积累。

进一步研究发现elesclomol诱导的细胞死亡不涉及 caspase 3 活性的切割或激活，同时当细胞凋亡的关键效应因子 BAX 和 BAK1 被敲除或当泛半胱天冬酶抑制剂（Z-VAD-FMK 和 Boc-D -FMK）处理细胞时，细胞死亡不能被拯救，表明铜诱导的细胞死亡与细胞凋亡不同。此外，用其他已知细胞死亡机制的抑制剂治疗——包括铁死亡（ferrostatin-1）、坏死性凋亡（necrostatin-1）和氧化应激（N-乙酰半胱氨酸）——都未能消除铜离子载体诱导的细胞死亡。表明铜离子载体诱导的细胞死亡是一种全新的细胞死亡途径。

图1：铜离子载体诱导的细胞死亡不同于凋亡，铁死亡等传统细胞死亡

三羧酸循环（TCA）与铜死亡密切相关

作者研究发现线粒体呼吸的细胞对铜离子载体的敏感性是糖酵解细胞的近 1000 倍，与对诱导铁死亡的 GPX4 抑制剂 ML162 的敏感性相比，用线粒体抗氧化剂、脂肪酸和线粒体功能抑制剂处理对铜离子载体的敏感性具有非常明显的影响。此外，电子传递链 (ETC) 的复合物 I 和 II 的抑制剂以及线粒体丙酮酸摄取的抑制剂减弱了细胞死亡，而对铁死亡没有影响。重要的是，线粒体解偶联剂 FCCP 对铜毒性没有影响，这表明铜诱导的细胞死亡需要线粒体呼吸，而不是三磷酸腺苷 (ATP) 的产生。与这一发现一致，在缺氧条件（1%O2 ）下生长的细胞减弱了铜离子载体诱导的细胞死亡，而在常氧条件下用 HIF 脯氨酰羟化酶抑制剂 FG-4592 强制稳定缺氧诱导因子（HIF）途径（21 % O2）却没有减弱细胞死亡，进一步强调了细胞呼吸在介导铜诱导的细胞死亡中的作用。然而，用铜离子载体处理并没有显著降低基础或 ATP 相关的呼吸，但确实显著降低了呼吸的备用能力，这表明铜不直接靶向 ETC而是 TCA 循环的组成部分。为了支持这一点，用elesclomol 处理细胞并进行代谢物分析，elesclomol 敏感的 ABC1 细胞中许多 TCA 循环相关代谢物失调呈时间依赖性增加，但在 elesclomol 抗性 A549 细胞中没有出现。这些结果建立了铜离子载体诱导的细胞死亡和线粒体代谢之间的联系，而不是 ETC，进一步阐明了铜和 TCA 循环之间的精确联系。

图2：线粒体呼吸调节铜离子载体诱导的细胞死亡

FDX1和蛋白质硫辛酰化是铜死亡的关键调节因子

为了确定介导铜死亡的特定代谢途径，研究者进行了全基因组 CRISPR-Cas9 功能缺失筛选，以确定参与铜死亡的基因。从这一筛选中研究者找到了七个正调控基因以及三个负调控基因，其中FDX1和蛋白质硫辛酰化（Protein lipoylation）是铜离子载体诱导细胞死亡的关键调控因子。单个基因敲除研究进一步证实，FDX1 和 LIAS 的缺失能够拯救铜死亡。值得注意的是，铜死亡与 FDX1 表达和蛋白质硫辛酰化之间的紧密联系在高浓度elesclomol（>40 nM）下消失，从而表明细胞的脱靶机制在这样的浓度下可能会发生死亡。

图3：FDX1 和硫辛酸基因是铜离子载体诱导的细胞死亡的关键调控因子

FDX1是蛋白质硫辛酰化的上游调节因子

蛋白质硫辛酰化是一种高度保守的赖氨酸翻译后修饰，已知仅在四种酶上发生，所有这些酶都涉及调节碳进入 TCA 循环的代谢复合物。作者发现敲除 FDX1 或硫辛酰化相关酶可以拯救铜死亡，使得作者探索 FDX1 是否可能是蛋白质硫辛酰化的上游调节因子。首先，通过癌症依赖图谱等数据库分析，作者们确认FDX1与蛋白质硫辛酰化相关。其次，作者们对 208 个人类肿瘤标本中的 FDX1 和硫辛酸进行了IHC染色分析， FDX1 和硫辛酰化蛋白的表达高度相关（p < 0.0001）。第三，使用硫辛酸特异性抗体作为 DLAT 和 DLST 硫辛酰化的量度来确定 FDX1 敲除是否影响蛋白质硫辛酰化。结果发现FDX1 敲除导致蛋白质硫辛酰化完全丧失，并且还导致细胞呼吸显著下降。此外，FDX1 缺失后的代谢物分析导致丙酮酸和 α-酮戊二酸的积累和琥珀酸的消耗，正如预期的那样，由于 PDH 和 α-酮戊二酸脱氢酶的 TCA 循环受到抑制，蛋白质硫辛酰化受到损害。这些结果均表明FDX1是蛋白质硫辛酰化的上游调节因子，并参与调控细胞铜死亡过程。

图4：FDX1是蛋白质硫辛酰化的上游调控因子

铜诱导的死亡机制与铜稳态失调的遗传模型类似

为了探索铜死亡机制是否与这些自然发生的铜稳态紊乱类似，研究者在HEK293T 和 ABC1 细胞中过表达铜转运体SLC31A1，铜的加入导致线粒体呼吸中涉及的蛋白质总体减少，蛋白质硫辛酰化减少，Fe-S 簇蛋白水平降低，以及HSP70 水平升高。重要的是，在过表达 SLC31A1 的细胞中，铁死亡、坏死性凋亡和凋亡抑制剂并不能拯救铜死亡，而铜螯合剂、FDX1 敲除和LIAS 敲除各自部分拯救了铜死亡。研究者进一步使用了威尔逊氏病的小鼠模型，将老年 Atp7b 缺陷 (Atp7b-/-) 小鼠的肝脏与 Atp7b 杂合子 (Atp7b-/+) 和野生型对照小鼠的肝脏进行比较，同样观察到硫辛酰化和 Fe-S 簇蛋白的丢失，以及HSP70 水平升高。这些结果表明，铜诱导的细胞死亡与铜稳态失调的遗传模型存在类似的分子机制，过量铜引发的蛋白硫辛酰化水平下降及Fe-S簇蛋白的不稳定可能是导致细胞死亡的重要原因。

图5：铜诱导的死亡机制与铜稳态失调的遗传模型类似

综上，该研究工作发现铜离子是一把双刃剑，一方面是很多酶关键的辅助因子，另一方面铜离子过量则会诱导细胞死亡。铜死亡的具体机制是通过结合硫辛酰化的三羧酸循环相关酶造成蛋白质毒性应激反应，从而诱导细胞死亡，这与传统细胞死亡机制都不同。

由于该工作所揭示的新颖的细胞死亡机制，同期刊发了评论文章题为Copper-induced cell death，铜离子跟铁离子等一样参与细胞死亡，同时该工作中所使用的小鼠疾病模型说明通过药物抑制线粒体呼吸可能是一个对抗疾病的策略，另外有些癌症中表达大量硫辛酰化的线粒体蛋白以及具有高度呼吸作用，利用铜离子金属载体杀伤癌症细胞将有可能成为新的治疗癌症的方法。

图6：Science同期评论文章

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