基于三代测序数据的结构变异检测，PBHoney方法解读

本文来自“生信算法”公众号。

基因变异普遍存在于同一物种内的不同个体中，如人与人之间的基因组是不完全一样的（即是多态的），彼此之间都存在着一些差异，即使是和父母或是兄弟姐妹之间去比较。这种差异也是基因组多态性的来源，通过外在和内在特征表现出来，比如头发和眼睛颜色，高矮胖瘦，抵抗力等。这些差异也是造成我们彼此之间不同的一个重要原因。

基因变异是一个相对的概念，只有在彼此的比较中才有存在意义。基因变异主要分为三大类：

单核苷酸变异，通常称为单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism），就是单个DNA碱基的不同，简称SNP；
小的Indel（Insertion 和 Deletion的简），指的是在基因组的某个位置上所发生的小片段序列的插入或者删除，长度通常在50 bp以下；
大的结构性变异，这种类型比较多，包括长度在50 bp以上的长片段序列的插入或者删除、染色体倒位，染色体内部或染色体之间的序列易位，拷贝数变异，以及一些形式更为复杂的变异。

为了和SNP变异作区分，第2和第3类变异通常也被称为基因组结构性变异（Structural variation，简称SV）。

结构变异长度少则几十bp，多则几万bp，对其检测带来了极大挑战。研究人员发现SV对基因组的影响比起SNP来说还要大，而且基因组上的SVs比起SNP而言，似乎更能用于解释人类群体多样性的特征。再者，一些SVs往往和一些疾病（包括癌症、自闭症、老年痴呆症）的发生相关联，甚至还是其致病的诱因。因此对SVs进行检测具有重要的意义。

二代测序技术产生的序列虽然精度高，但读段短（100~500 bp），不能跨越大多数长度较长的SVs区域，但基于单分子测序的三代测序技术（如PacBio，牛津纳米孔测序）可以测得长达100 kpb的序列，轻松跨越各种SVs区域，为SVs检测带来方便。但其错误率较高（~15%），因此需要专门的SVs检测算法。PBHoney是较早利用三代序列进行SVs检测的软件。

PBHoney方法

PBHoney主要利用两种序列比对情况进行检测。如下图所示，一种是Interrupted long-read mapping，一种是 Intra-read discordance。主要原因在于对于一条比对的三代序列，比对情况可以分为这两种。

所谓Interrupted long-read mapping ，就是这条序列只比对了一部分，其前缀或者后缀的序列片段没有比对上去。

下图是 Intra-read discordance比对示意图，所谓 Intra-read discordance，就是整条序列都比对到参考基因组上，但某些比对区域由于SVs存在比对质量较低，存在较多非匹配状态。

PBHoney首先采用三代序列比对算法BLASR进行序列比对，然后针对这两种比对情况做相应的处理，找出SVs区域。

处理 Interrupted long-read mapping序列

首先将提取没有比对的前缀或者后缀，如果长度大于200 bp，再将这些片段通过BLASR比对到参考基因组上。然后与原来比对的序列（initial alignment）组成piece-alignment，如下图所示。后缀比对的片段称为epilog，前缀比对的片段称为prolog。

然后对每个piece-alignment进行聚类处理：

只考虑包含initial alignment 和 epilog （或prolog）的piece-alignment。如果epilog和prolog都存在，（如上图3）所示，只考虑比对质量高的。
保留initial alignment 和 epilog （或prolog）之间的距离小于200 bp的piece-alignment。200 bp是默认值，用户可自己设置。保留下来的piece-alignment称为一个cluster。
SVs的位置（起始位置和结束位置）就是每个cluster中比对位置的平均值。如下图所示。

处理 Intra-read discordance 序列

对于完整比对上的序列，如上图所示，通过以下步骤进行处理：

1. 计算比对到基因组序列每个位置的替换（mismatch）、插入、删除碱基个数、及覆盖率。构成一个4×G大小的数组A，其中G是参考基因组的序列长度。

2. 然后计算基因组每个位置的错误率大小：

其中j=1,2,3,4. Ci表示覆盖率。

3. 通过下面公式对E矩阵进行变换：

4. 再次对M矩阵进行变换：

其中步骤3）和4）目的是寻找一些差异比较大的值，更好判断是否是SV。

下图是通过以上步骤检测一个删除SV的示意图。可以看出步骤3）和4）可以将A柱状图转变成脉冲信号，方便SV检测。

结果

下表是PBHoney的检测结果，可以看出其灵敏度和PPV值还是不错的，这篇文章是以软件类（software）形式发表的，没有和别的方法进行比较。

总结

SVs检测对于疾病治疗具有重要意义，随着三代测序技术的不断发展，其测序准确性和序列长度会不断改善，相信基于三代序列的结构变异检测会得到越来越多的关注。

参考文献

English A C, Salerno W J, Reid J G. PBHoney: identifying genomic variants via long-read discordance and interrupted mapping. BMC bioinformatics, 2014, 15(1): 180.
https://blog.csdn.net/alex6plus7/article/details/50236375