上篇文章主要讲述了转录组测序的上传与检测完整性，今天的内容是如何远程连接服务器并且查看测序文件的结构。

补充上篇文章

一般做转录组测序都会做三个生物学重复。因为大多数老师都会让学生做重复，就忘记提了。但是为了文章能够完全面对零基础的读者们，还是补充一下比较好。

另外服务器IP的话，我实验室的服务器连接在路由器上，因此我直接查看路由器的设置，看看IP是啥。不知道自己服务器的IP的话，问下实验室管理服务器的人是谁就知道了。

RNA-seq分析流程

转录组测序数据的结构

当成功上传服务器之后，就需要远程连接服务器上进行后续的操作。远程连接的软件有很多，我个人用的远程连接软件是MobaXterm（https://mobaxterm.mobatek.net/download.html。官方的网站，下载免费版安装即可。我就一直用的免费版的），因此这个软件可以在操作命令行的同时查看当前目录的文件。如下图：

这个是软件。

连接方式：

点击右上角菜单栏下面第一个Session，选择SSH。

Remote host：输入服务器IP。

Specify username ：输入你的账号名。我的就输入hsq。

点击下面的OK。

然后出现下面界面（我的账号已经记住了密码，直接会进入命令行，下面的账号名叫qmh），让你输入密码。输入时界面是不会显示任何字符（防止他人看到），正常输入即可，回车就进入命令行模式。成功连接服务器。

转录组测序数据查看

首先服务器都是linux系统，跟平时用的windows电脑不一样，切换文件夹不能使用鼠标。Linux切换命令行是cd。下图是我的主界面：

我的转录组测序在zhanshi这个文件夹中，我就输入cd zhanshi/。（cd后面是有个空格）

回车就进入zhanshi这个文件夹中，想回到上一级目录，就输入cd .. （两个点）。

更多关于相关的cd命令，百度一看就懂。

（小技巧：如果当前目录只有一个zhan开头的文件夹，输入cd zhan时直接按下TAB键，会自动补全。若只有仅一个z开头的，输入cd z时直接按下TAB键即可）

测序数据主要是fq.gz的压缩文件。在Linux下，我一般查看文件的方式是cat 文件名|less -S（cat与less后各有一个空格），然后方向键上下左右看文件。如果想返回命令行，就按下q。而压缩文件一般使用zcat。比如我想查看s1_1.clean.fq.gz这个文件，就输入zcat s1_1.clean.fq.gz |less -S

就会显示下图。

测序文件中以4行文本作为一个reads的信息。

第一行：表示reads的ID名。

第二行：reads的序列，即（ATGC）。

第三行：＋号（一般不管）。

第四行：reads的碱基质量。

我只关注第二行与第四行（一个碱基对应一个质量值，因此第二行与第四行的字母数完全相等）。

第二行是测序的碱基，这个没什么说的，是啥就是啥。

第四行是测序碱基的质量（即这个碱基测序准不准），用ACSII码表示。

关于第四行的碱基质量转换有点复杂。我只做简单说明，如果一个碱基出错的概率是0.001，那对应的Q值Q=-10log10(0.001)=30，如果测序质量值的体系是phred33，那在第四行的字母就是(30+33)对应的ACSII码为“?”。如果一个碱基出错的概率是0.01，Q值就是20，第四行的字母就是(20+33)对应的ACSII码为“5”。

目前高通量测序reads质量值有phred33体系和phred64体系（不同的测序公司不用的体系，大部分都是phred33），如何查看哪种体系使用如下命令。

zcat s1_1.clean.fq.gz | head -1000 | awk '{if(NR%4==0) printf("%s",$0);}' | od -A n -t u1 | awk 'BEGIN{min=100;max=0;}{for(i=1;i<=nf;i++) i="">max) max=$i; if($i<min) min=$i;}}END{if(max<=74 && min<59) print="" else="" max="">73 && min>=64) print "Phred+64"; else if(min>=59 && min<64 max="">73) print "Solexa+64"; else print "Unknown score encoding!";}'

第三行显示是phred33体系。我目前见过的测序数据中（DNA重测序，转录组测序，甲基化测序）全部都是phred33体系。

关于介绍这个phred33体系的目的是：后续去除碱基时，软件需要选择是phred33还是phred64，所以就简单介绍下并且分享检测体系的代码。

一些题外话

首先关于下载软件与代码分享，一些官网的软件我仅仅放网站，大家稍微看下就能够下载，安装时不要不要不要选择C盘（只有R语言的软件我会安装在C盘），剩下的就是下一步下一步就可安装。一些不好下载的软件我会分享给大家。

我自己用的代码会直接放在文章中，大家都可以直接使用。关于学习代码部分来说，今天用的zcat s1_1.clean.fq.gz |less -S这个命令来说，我只简单介绍了一下zcat，但是后面的竖线与less -S我并没有介绍（|：管道操作符，可以将|前的内容直接输入后less中，而less -S表示将内容进行单行展示，如果输入less -SN会同时展示行数），可以直接输入zcat s1_1.clean.fq.gz，看看会怎么样（屏幕会不断刷新内容，这时按Ctrl+C 就会终止）。以后如果没有介绍|与less -S这种类似的代码含义，大家可以直接百度查看。而我会展示我自己的习惯（我查看文件一般都是用cat 文本名|less -S 或者 zcat 文本名|less -S）。因为我也不可能把所有的命令参数介绍完，只介绍我个人的习惯就可以了。

本节先介绍到这里，下节会介绍如何安装生物数据分析的软件以及fastqc软件检测测序文件。fastqc检测测序文件本节并没有介绍，因为忘了还需要告诉你们如何安装软件。

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