GATK，全称是Genome Anlysis Toolkit，顾名思义，是一套用于分析基因组的工具箱。主要功能是寻找变异位点和基因分型，但是实际上功能超多，导致初学者都不知道从何学习GATK。

最近因为mapping-by-sequencing要寻找variant，所以接触了GATK。我相信很多人第一眼看到GATK是茫然的，因为它的功能实在是太多了，都不知道从何开始。这里就说下我是如何在一脸茫然的情况下学习GATK。

GATK的功能虽然超级多，但主要可以归为以下几个方面：诊断和质量控制工具(Diagnostics and Quality Control Tools)

序列数据处理工具(Sequence Data Processing Tools)

变异位点探索工具(Variant Discovery Tools)

变异位点评估工具(Variant Evaluation Tools)

变异位点操作工具(Variant Manipulation Tools)

注释模块

读段(reads)过滤

资源文件解码工具

参考序列实用工具

如何快速建立GATK的心理表征

这里面的每一项点开都有好多内容，我第一次点开的时候，也是一脸茫然，不知道从何入手。

但是根据《认知学习法》，最好的学习方式就是“不要怂，直接上”，找到一个已有流程，先把代码敲上去，然后慢慢理解每一行代码的作用，建立一个模糊的心理表征，然后循序渐进，慢慢学习其他工具，最后就能熟练使用GATK了。

所以记下来主要的任务，就是带大家建立关于GATK的模糊概念。

mapping-by-sequencing其中一个重要环节就是“SNP calling”，我最初用的是samtools和bcftools,结果的variant特别多(估计很多是假阳性).虽然最后还是找到了causual mutation, 但是为了保证今后causual mutation的准确性，我发现了有文章使用了GATK。他给的代码如下：1. Add read groups (Picard tools)

AddOrReplaceReadGroups.jar I=sorted.bam_file O=s1.rg.bam RGLB=genome RGPL=ILLUMINA

RGPU=GATKv4 RGSM=sample_name VALIDATION_STRINGENCY=LENIENT

2. Mark duplicates (Picard tools)

MarkDuplicates.jar INPUT=s1.rg.bam OUTPUT=s2.dedup.bam ASSUME_SORTED=TRUE

VALIDATION_STRINGENCY=LENIENT METRICS_FILE=s2.dedup.metrics

3. Index (samtools)

samtools index s2.dedup.bam

4. Realign reads (create intervals first, then do IndelRealigner) (GATK)

GenomeAnalysisTK.jar -I s2.dedup.bam -R ref_file -T RealignerTargetCreator -o s3.intervals

GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -I s2.dedup.bam -R ref_file -targetIntervals s3.intervals -o

s4.realn.bam

5. Unified genotyper (GATK)

GenomeAnalysisTK.jar -T UnifiedGenotyper -R ref_file -I s4.realn.bam -glm BOTH -o s5.UG1.vcf -mbq 30 -nt4

6. Base score recalibrator (GATK)

GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -I s4.realn.bam -R ref_file -knownSites s5.UG1.vcf -o s6.recal

7. Print Reads (GATK)

GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads -R ref_file -I s4.realn.bam -BQSR s6.recal -o s7.recal.bam

8. Unified Genotype (GATK)

GenomeAnalysisTK.jar -T UnifiedGenotyper -R ref_file -I s7.recal.bam -glm BOTH -o s8.UG2.vcf -mbq 30

9. Base score recalibrator (GATK)

GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -I s4.realn.bam -R ref_file -knownSites s8.UG1.vcf -o s9.recal

10. Print Reads (GATK)

GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads -R ref_file -I s4.realn.bam -BQSR s9.recal -o s10.recal.bam

11. Unified Genotyper (GATK)

GenomeAnalysisTK.jar -T UnifiedGenotyper -R ref_file -I s10.recal.bam -glm BOTH

第一步： 不管三七二十一直接把代码自己敲一遍。

第二步： 读每行代码的解释，理解他的意图用了picard tools的AddOrReplaceReadGroups.jar加了read group，根据以前百度GATK的经验，了解GATK要求bam文件的header必须包含@RG，所以这一步应该是前面比对时候，没有在参数中增加相应部分。所以如果我在比对的时候增加了这个参数，这一步就可以免了。

用picard tools的MarkDuplicates.jar去重。这是因为二代测序有一部桥式PCR扩增底物的过程，在100x以上出现reads重复，很大可能是PCR扩增重复了，所以可以直接去掉。

samtools的index，建立索引，提高检索效率。

先建立indel区间文件，然后对该区域进行reads重比对。这一步我没有经验，然后我在GATK的论坛搜索了这个工具，发现原因是indel会导致附近的错配，所以需要借由这一步降低indel附近的假阳性。但是最新的HaplotypeCaller or MuTect2已经不需要了，这些工具的haplotype组装步奏效果类似。这里的UnifiedGenotyper or the original MuTect.还是要的。

使用UnifiedGenotyper寻找variant。论坛搜索发现，现在推荐用HaplotypeCaller，效果更好。

根据上一步得到vcf文件对第四步得到BAM文件进行碱基重校准，得到校准所需的文件。

使用PrintReads根据第6步得到的文件，对第四步得到的BAM文件进行校准

根据重校准的BAM文件重新找variant。

根据第8步的文件进行校准

输出第二次校准后BAM文件

第三次寻找variant。

第三步：根据上述过程对拟南芥中使用GATK寻找variant建立大致的认识：常规步骤： 先比对，比对后把SAM转成BAM然后排序，建立索引，去除PCR重复

对indel附近进行重新比对

由于拟南芥没有已知的VCF文件让UnifiedGenotyper学习，所以需要通两轮碱基校准和variant calling降低假阳性

第四步： 再看看别的流程，不断修改最初的认识。我通过翻文献又找到了一个perl脚本# 第一行，UnifiedGenotyper

# 输出read-$i.snv-gatk-snp.vcf

&execsys("java -Xmx2G -jar $cfg{gatk_dir}/GenomeAnalysisTK.jar -T UnifiedGenotyper -R $cfg{genome} -I read-$i.recal.bam -D known_snp.conv -A AlleleBalance -stand_call_conf 50.0 -stand_emit_conf 10.0 -dcov 200 -glm SNP -out_mode EMIT_VARIANTS_ONLY -log log.UnifiedGenotyper-snp.$i -o read-$i.snv-gatk-snp.vcf");

# 第二行，VariantFiltration,

# 过滤read-$i.snv-gatk-snp.vcf得read-$i.snv-gatk-snp.fil.vcf

&execsys("java -Xmx2G -jar $cfg{gatk_dir}/GenomeAnalysisTK.jar -T VariantFiltration -R $cfg{genome} -V read-$i.snv-gatk-snp.vcf --clusterWindowSize 10 --filterExpression \"QUAL < 30.0 || QD < 5.0\" --filterName \"HARD_TO_VALIDATE\" -log log.VariantFiltration-snp.$i -o read-$i.snv-gatk-snp.fil.vcf");

# 第三行 UnifiedGenotyper # 输出read-$i.snv-gatk-indel.vcf&execsys("java -Xmx2G -jar $cfg{gatk_dir}/GenomeAnalysisTK.jar -T UnifiedGenotyper -R $cfg{genome} -I read-$i.recal.bam -D known_snp.conv -A AlleleBalance -stand_call_conf 50.0 -stand_emit_conf 10.0 -dcov 200 -glm INDEL -out_mode EMIT_VARIANTS_ONLY -log log.UnifiedGenotyper-indel.$i -o read-$i.snv-gatk-indel.vcf");

# 第四行 VariantFiltration

# 过滤read-$i.snv-gatk-indel.vcf得read-$i.snv-gatk-indel.fil.vcf

&execsys("java -Xmx2G -jar $cfg{gatk_dir}/GenomeAnalysisTK.jar -T VariantFiltration -R $cfg{genome} -V read-$i.snv-gatk-indel.vcf --clusterWindowSize 10 --filterExpression \"QUAL < 10.0\" --filterName \"HARD_TO_VALIDATE_1\" --filterExpression \"MQ0 >= 4 && ((MQ0 / (1.0 * DP)) > 0.1)\" --filterName \"HARD_TO_VALIDATE_2\" -log log.VariantFiltration-indel.$i -o read-$i.snv-gatk-indel.fil.vcf");

#第五行 CombineVariants

# 结合read-$i.snv-gatk-snp.fil.vcf和read-$i.snv-gatk-indel.fil.vcf

&execsys("java -Xmx2G -jar $cfg{gatk_dir}/GenomeAnalysisTK.jar -T CombineVariants -R $cfg{genome} --variant read-$i.snv-gatk-snp.fil.vcf --variant read-$i.snv-gatk-indel.fil.vcf -o read-$i.snv-gatk.vcf.tmp -log log.CombineVariants.$i");

好像和之前建立的模型不太一样呀，这里变成先找variant然后过滤了。

但是，这些流程所用的工具基本都来自于序列数据处理工具(Sequence Data Processing Tools)

变异位点探索工具(Variant Discovery Tools)

变异位点评估工具(Variant Evaluation Tools)

其实都是先找到variant，然后通过各种方法降低假阳性。

小结

总结一下：

GATK常用套路就是先找variant，然后降低假阳性(例如BQSR, VQSR或直接过滤等)

有了这样一个大致印象后，我再去学习GATK Best Practices，就稍微有点思路了。

这些就是我这段日子学习GATK的感悟，不涉及到具体的操作。希望大家能够提供更多GATK相关的pipeline，让我能够不断更新自己的心理表征。