概述

Beckers, B., et al. (2017). Microbiome 5(1): 25.
这篇文章分析了白杨树不同区域的细菌组成和差异，16S分析中非常中规中矩，而且没有任何后续实验，但在今年还能发这么好的杂志，大家可以一起分析一下原因。

摘要

材料方法：取根际土、根、茎和叶内组织进行16S扩增子分析
目的：分析不同生态位的细菌群落结构
结果：相比内生菌，根际微生物组结构更稳定；不仅发现了根际和根的差异，而且继续研究了茎和叶中的内生菌。而且每一个植株也有独立的生态位。最终鉴定了杨树不同生态位的核心细菌。
结论：理解杨树复杂的宿主与微生物互作，为解释原核和真核相关的植物修复应用、可持续农业和次生代谢物产品提供理论基础。

结果大纲

生成OTU表
Alpha稀释曲线和多样性
Beta多样性
每种Compartment中的核心菌成员

表1. 测序结果质控统计

先确定来自非细菌16S(古菌、叶绿体和线粒体)，每一种生态位中singltetons的比例，以及在门水平仍无法分类的结果；发现根际土中singleton的比例高。

图1. 每种生态位(Compartment)中每株白杨绘制稀释曲线

A 根际土、B 根、C 茎、D 叶。展示测序的饱合情况，同时展示不同生态位的差异(Y轴坐标不同，即Alpha多样性差别很大)，还有每颗树间也有较大的差别(图中的每条线代表来自一棵树的样品)

图2 Alpha多样性

图2. 箱线图展示细菌群体的Alpha多样性。四个箱体分别代表根际土(Rhizosphere soil)、根内生菌(Root endosphere)、茎内生菌(Stem endosphere)、叶内生菌(Leaf endosphere)。
- (A) 采用Observed OTUs方法估计OTU丰富度(richess)，即有多少物种；
- (B) 采用Pielou方法估算OTU的均匀度(evenness)，即各OTU相对丰度间关系；是一种常见enenness指数算法，计算方法是将Shannon-Wiener熵除以OTU数量的自然对数；一般生态学领域比较关注，功能研究者更关注最终的差异OTU；
- (C) 使用反向Simpson指数计算多样性(diversity)，是mothor中的方法，来自dominance指数的变形，而dominance计算为每个OTU比例平方再求合，与shannon的方法类似，原理是想用一个数代表整体群体中每个OTU的数量和丰度信息(richness和evenness)，我更常用Shannon方法；
- 差异分析：整体上使用ANOVA统计，存在显著差异，P<0.0001；图中字母代表组间组间Turkey两两比较的结果，相同字母的箱体代表组间无显著差异，而不同字母组间存在显著差异；有时会出现同一组出现2个字母的情况，是一种过渡状态，与这两个组均无显著差异。
- 图片优点：(A) Observed OTU数量展示使用了截断图，因为根际土中微生物数量是非常大的，而内生菌种类很少，使用截断图减少图中留白更加美观；不同种组织的颜色选用与实物相近，使人产生亲切感(根深棕，茎浅绿和叶深绿)；
- 图片解读：根际土中细菌近千种；根中内生只有2-3百种(也有可能根没洗干净，技术上不容易区分根表还是根内)；茎和叶百种左右(其中部分也可能只是来自于表面或污染)；此外结果的排列给人传达了由外到内，由上到下有特种数量下降的趋势；

图3. Beta多样性:主成分分析和层级聚类样品

A. 主成分分析PCA各样，发现在平面上主要分为三类：根际土、根、茎和叶。并把主要的OTU差异用向量显示出来，也叫loading plot。可以看到每类中主要显著富集的OTU，相当于差异OTU分析，但缺少统计。
B. 基于Bray-Curtis距离的层级聚类，也明显将样品按生态位/取样部位分为三大类，表明通常不同生态位间的差异明显，远大于样品间的差异。而茎和叶间差别不大。

图4. 各样品OTU在门水平分类的相对丰度柱状图

图中展示了每个Compartment的每个样品门水平的相对丰度；其中Proteobacteria由于组比较大，也将其分成了apha, beta, gamma, delta, epislon五类展示；高丰度的前7类用彩色显示，其它低丰度的门用灰色显示。

图5. 全部样品中高丰度的OTU

此图采用iTOL生成；图中间为OTU的进化树；每个菌的种名按门水平上背景色，表明分进化关系与分类结果一致性很好；外圈的柱状图为其相对丰度值。

总结

文章分析很常规，样本量也非常大，但是描述和结果很清楚，并将所有样品均展示出来，表现数据最原始的样子，值得学习。

有时最原始、最简单的结果，反倒是更好的。

Reference

Beckers, B., et al. (2017). “Structural variability and niche differentiation in the rhizosphere and endosphere bacterial microbiome of field-grown poplar trees.” Microbiome 5(1): 25.

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