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DNA测序(A,T,C,G),DNA一级结构。

核苷酸序列测定的两种方法

第一代DNA测序:

1、Snager双脱终止法(双脱氧链末端合成终止法)

2、Gibert化学降解法

3、荧光自动化测序

测序的机理??

DNA测序:(最初的测序仪一次只能测4个样,且分四个用到进行)

在DNA合成的基础上,采用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)【 聚丙烯酰胺凝胶电泳( polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术,用于分离 蛋白质 和 寡核苷酸 。 作用原理:聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应。它有两种形式: 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Native-PAGE)和 变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳。】获得的结果。聚丙烯酰胺凝胶电泳:可以分辨仅一个碱基差别的单链寡核苷酸。

测序时的DNA合成与普通的DNA合成的异同点

同:都需要引物、模板、酶以及底物

异:DNA测序的底物除了dNTP【 dNTP,deoxy-ribonucleoside triphosphate( 脱氧核糖核苷 三磷酸)的缩写。是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP,等在内的统称,N是指 含氮碱基 ,代表变量指代A、T、G、C等中的一种。在生物 DNA 合成中,以及各种PCR( RT-PCR (reverse transcription PCR)、Real-time PCR)中起原料作用。】外,还含有一定量的双脱氧核苷酸ddNTPs

全自动测序

DNA测序流程

单链DNA模板-DNA合成(掺入4种荧光标记)-毛细管电泳-荧光检测-DNA自动排序(计算机分析)

毛细管电泳(ABI 310)【取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,提高了自动化程度,其测序通量以及准确率也得到进一步提升】

测序仪器的发展技术

1986年美国全球第一台测序仪370(一次一个样)-3130(四个)-3130XL(十六个)-3730(四十八)-3730XL

3730XL(毛细管)-96个样

全自动灌胶、进样,定量。

电脑:资料收集,分析,操作

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