微生物测序样本准备方法

原文转自诺禾致源，链接详见文末。本人有修改，并添加自己的经验。

在微生物测序中，样本的准备从根本上是确保获得高质量DNA的前提，而样本准备也正是让众多微生物科研工作者感到困扰的重要一步。今天就给大家分类介绍一下常见的微生物样本类型及采样方法。

医口样本类型

样本	种类	推荐生物学重复
肠道	粪便,粘膜	6, 推荐 10
液体	尿,血液,脑髓液,唾液,痰,肺泡灌洗液,羊水	同上
拭子	口腔,生殖道,皮肤	同上
其它	组织,肝脏,眼部,胎盘等	同上

农口样本类型

样本	种类	推荐生物学重复
土壤	普通土,根际土,稻田土,污泥,沙土	3(多点取样), 推荐5
水体	水库,河流,污水,海水,中水,油田,尾矿池,牛奶	同上
肠道	动物粪便,肠道	6, 推荐>10
其它	根内生菌,瘤胃,发酵液,单菌,病毒	同上

医口常见样本采集方法

粪便样本采集
1）准备好便盆和粪便容器，洗手，带上手套收集新鲜的粪便样本；
2）在实验室将装好受试者粪便样本，立即放在冰上进行分装并标记；
3）用无菌牙签或粪便取样器截取样品中段里部（粪便表层含有肠粘膜脱落细胞），外部容易污染，且接触空气后，部分细菌 DNA 开始降解；
4）用灭菌离心管每管称取0.5-10g左右粪便样本，每个样本取多管备份；
5）分装好后，若当天提取DNA，可以先放4°C，长期存放需先迅速放入液氮中，之后立即放入-80°C保存。
注：如粪便样品量较多或不能马上收集，最迟要在2小时之内全部收集完。
肠道内容物样品采集
1）在实验对象死亡后，用无菌解剖刀，在无菌状态下取出整个肠道，切取所需肠段的内容物（条件允许的话，可在无菌操作台进行）；
2）用无菌手术刀挖取内容物，立即放在冰上进行分装并标记；
3）用灭菌离心管分装，单个样本取样量：0.2-0.5g/管。为保证实验顺利进行，每个样本取多管备份，在采样允许的情况下，尽量多采集样品；
4）分装好后，若当天提取DNA，可以先放4°C，长期存放需先迅速放入液氮中，之后立即放入-80°C保存。
肠道组织样本采集
1）组织样本用无菌磷酸盐缓冲液轻轻清洗，直到没有内容物流出；
2）用无菌的显微镜玻片刮取附着在表面的组织细菌进行DNA的提取；
3）长期存放需先迅速放入液氮中，之后立即放入-80°C保存。
生殖道样本采集
1）48h内无性行为，不得进行私处清洗、上药等改变菌群结构的行为，30天内不能用抗生素和抗真菌类药物；
2）用无菌棉签充分取样，用无菌剪刀剪下棉签头部，放入装有Amies培养基的无菌离心管中，置于冰上带至实验室-80℃保存；
3）样本珍贵，需进行多管备份保存；
4）提取DNA时将棉签解冻，漩涡处理5min以重悬细胞。
唾液样本采集
1）收集唾液样品时，用蜡胶刺激口腔分泌唾液，然后用5mL的无菌离心管收集1mL；
2）所有的样品收集完后放于-80°C下保存。

农口常见样本采集方法

普通土壤样本采集
1）根据研究目的确定采样范围，取样器具要事先消毒灭菌处理，开始采样；
2）去除表面浮土，使用乙醇火烧的铲子挖取地下5~20cm的土层；
3）去除可见杂质后，土壤过2mm筛网，每个样品从3个及以上采样点采集并混合而成，每5～10g分为一份；
4）保存于无菌离心管中，置于0℃以下运回实验室，用于抽提DNA；
5）如不能马上提取，置于-80℃保存。
根际土壤样本采集
1）使用的器具要事先消毒灭菌处理，采集20cm深的根际土壤于50mL的无菌管里；
2）用20目的筛子过筛，去除植物根、动物残骸以及其他杂质后分装到无菌离心管里，每管3~5g，迅速放在液氮里储存；
3）密封后立即放于-80℃储存备用。
水体样本采集
1）根据研究目的确定采样深度和范围；
2）采集好的水样需要通过滤膜进行过滤，可以根据水样的浑浊程度选择相应孔径的滤膜；
3）将滤膜-80℃保存备用。
注：清亮水样：可选择小孔径的滤膜，一般选0.22μm或0.45μm的滤膜，过滤水样体积大于10L；
浑浊水样：过滤前静置分离悬浮颗粒，也可以用大孔径的滤膜预过滤一遍，再用小孔径的滤膜进行过滤。
活性污泥及沉积物样本采集
活性污泥：从曝气池中取25mL悬浮的活性污泥样本放入无RNA酶的管中，迅速放入液氮并运送到实验室提取DNA；
地表沉积物：取距地表0-10cm的地表沉积物，每个位点取1-2kg的沉积物装入消毒聚乙烯塑料袋中，立刻置于0℃运到实验室进行DNA提取。
植物内生菌样品采集
1）用流水冲洗植物根样本表面并摘到小侧根，粘根土壤粒要进行化学消毒（95%的次氯酸钠2min）；
2）用无菌玻璃珠在无菌水中剧烈摇晃，物理去除细菌；
3）用手术刀片划开根部组织以释放内生菌；
4）用无菌玻璃珠在9%的生理盐水中振荡，在30℃的条件下振荡4h以分离内生菌；
5）用5μm滤膜过滤，15000rpm，4℃离心收集沉淀并置于液氮中保存。

微生物多样性研究非常规样本取样方法

小鼠肺泡灌洗液

肺部感染是一种常见疾病，病原种类多，耐药性强。支气管肺泡灌洗液（ bronchoalveolar lavage fluid，BALF）直接取材于病变部位，获得病原菌的机会多，并能大幅减少口咽部定植微生物群对标本的污染，提高病原菌的分离率。

小鼠肺泡灌洗
一般为颈部和胸部解剖，气管和一侧肺叶结扎。再用穿刺针插入气管上端，生理盐水或PBS反复冲洗，一般为3遍，每遍冲洗次数根据需要决定， 3~5次即可，具体操作参考：

1）操作所需的设备（所有设备均需是无菌的）；

2）小鼠麻醉并固定；

3）颈部去毛并消毒；

4）行颈部正中切口；

5）暴露剥离气管，并在气管近端穿线打活结，活结要比较松；

6）在所打活结的远端，剪开气管的1/2，行气管插管，插入后线打死结；

7）1ml注射器抽取1ml的灭菌生理盐水，通过气管插管注入气管内，注意针头不要插太深，以免损伤肺，反复抽吸三次，将液体抽出，大约能吸出0.7ml左右，放入灭菌离心管内。再抽取1ml生理盐水，重复上面的操作两次，这两次每次能抽出肺泡灌洗液0.9ml左右，也注入离心管，如果回收时遇到很大的阻力即可拔出注射器，收集灌洗液，在灌洗的时候可以轻轻的按摩一下，特别是回抽的时候可以这样做，能够提高回收的效率；

8）收集的灌洗液采用0.22um滤膜过滤后，将滤膜冻存-80℃，或直接提取DNA。

上呼吸道样本制备

上呼吸道感染有70%～80%是由病毒引起的，包括鼻病毒、冠状病毒、腺病毒、流感和副流感病毒、呼吸道合胞病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒等。另有20%～30%由细菌引起，细菌感染可直接感染或继发于病毒感染之后，以溶血性链球菌最为常见，其次为流感嗜血杆菌、肺炎球菌、葡萄球菌等。

取样材料
无菌棉拭子、含采样液的无菌外旋塑料管。
鼻腔取样
尽可能使明亮的光线照进鼻腔，将洁净的鼻咽拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头浸入采样液中，尾部弃去，拧紧盖子。
咽喉取样
明亮的光线从检查者肩膀上方照射进张开的口腔，让患者深呼吸，然后发“啊”音，用压舌板轻轻压舌，再用洁净的咽拭子来回擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，然后将拭子头浸入采样液中，尾部弃去，拧紧盖子。

注意事项：
1）咽喉取样时，拭子不能接触到口腔和舌粘膜。

2）取样时间最好在发病72小时内，晨起后。

3）鼻腔和咽部样品，可只收集一种，也可同时收集2种并混合。

皮肤样本制备

洁净的皮肤拭子（无菌棉签）来回擦拭皮肤表面，将拭子或棉签放入无菌管内，－80℃保存，干冰运输即可。建议多擦拭几个拭子，保证取样量。

Reference

http://mp.weixin.qq.com/s/PyxyVIAJ74S2GuipVxORqQ
http://mp.weixin.qq.com/s/jbqqfwB3y0lZaVTAthGAoA