作者简介：焦硕，博士毕业于西北农林科技大学，目前在北京大学做博士后。

文章链接 https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2016.04.005

主编按：此文于2016年发表于Soil Biology and Biochemistry (IF=4.926)，文章思路清楚、图表美观，发表不到两年引用24次(超杂志平均引用2倍)，更被众多同行选为经典学习材料示范和解读。今天诚邀本文第一作者讲解此文，以飨读者。

石油污染土壤微生物群落构建与生物多样性研究

引言

随着分子技术的发展，土壤微生物生物地理学时间和空间的微生物分布模式越来越多的受到关注。最初，环境因子被认为是影响微生物群落变化的主要驱动力，例如，土壤pH值、养分、土壤质地、气候条件都可以显著影响微生物群落分布。然而，近期研究发现微生物的非随机分布不仅受环境因素的影响，还与地理距离显著相关，地理距离可以限制微生物的扩散。土壤中包含多种多样的微生物类群，为适应石油污染环境，许多能降解有机污染物的微生物会自然富集。在本研究中，作者利用高通量测序技术探索石油污染土壤中微生物群落结构，分析环境因子和地理距离对微生物分布的影响。样品采自中国陕西洛川县（JKH）、永坪镇(YP)、延长县(YC)、咸阳市(XY)、靖边县(JB)五个地区的石油污染土壤。通过研究石油污染地区的微生物群落组成、土壤环境因子与微生物群落之间的关系、地理距离对微生物群落的影响、响应石油污染物的微生物的共发生模式等内容，拟揭示长期石油污染地区，土壤微生物的生物地理分布模式和生物多样性，为生态系统修复和环境治理提供有价值的线索。

1. 微生物群落与环境因子

图1（A）基于土壤理化特性的主成分分析，α-多样性指数和土壤理化因子拟合子在排序图中。（B）和（C）pH和总石油烃含量与微生物丰富度之间的线性回归关系，总石油烃含量进行了对数变换。缩写：总氮 total nitrogen (TN), 可用氮 available nitrogen (AN), 总磷 total phosphorus (TP), 可用磷 available phosphorus (AP),可用钾 available potassium (AK), 重金属镉 the heavy metals cadmium (Cd), 铬chromium (Cr)和 铅lead (Pb)。

以土壤理化因子作为变量进行主成分分析（图1），α-多样性指数包括：丰富度(Richness)，均匀度 (Evenness)，香农多样性(Shannon)和系统发育多样性 (PD)被拟合到排序图上。α-多样性与土壤pH呈现正相关关系，而与TPH、TN和AP呈现负相关关系。土壤pH和总石油烃含量与微生物丰富度表现出显著的线性回归关系。

采样点地图通过GenGIS II（Parks et al. 2013）制作，样点地理位置与群落结构和环境差异之间的相关关系在图中展示，不同采样点的环境差异与微生物群落之间的相关关系如图2，发现了很明确的对应关系，通过Mantel检验确定了这种对应关系的显著性（r=0.4195，P=0.001）。

图2 地理空间映射生物多样性分析，树状图是不同样点间基于微生物群落结构的Bray−Curtis距离和环境因子的欧几里德距离。彩色分支对应不同的样点，白色分支表示包含两个或两个以上样点，饼图表示每个样点所有样品的平均门水平的相对丰度。

图3（A）基于Bray−Curtis距离的限制性主坐标分析；（B）偏最小二乘回归分析，环境因子用黑体表示，微生物类群用灰色字体表示。

接下来，作者通过基于Bray−Curtis距离的CAP分析（图3A），探究环境因子对微生物群落差异的贡献。在所有测定的理化因子中，pH、TPH、TN和Cd显著影响微生物群落。而pH是其中贡献最大的环境因子。为了证实结果的可靠性，最佳变量子集分析（BEST）确定了pH、TN、Cd和TPH是影响微生物群落结构差异最重要的环境因子。偏最小二乘回归分析用来揭示微生物类群与环境因子之间的相关关系（图2-3B）。作者选取相对丰度大于0.5%，从门到属水平，且能解释大于40%方差的微生物类群。结果显示，Cd与Desulfovibrionales、Thauera、Desulfomicrobium和Rhodocyclaceae存在强烈的正相关关系；TPH与Gammaproteobacteria、 Caulobacteraceae和Xanthomonadaceae呈现弱相关性；而pH与Acidobacteria-6、Solirubrobacterales和Ellin6529呈正相关。

2. 微生物群落的空间分布与差异分解分析

群落相似度与地理距离之间存在显著的负线性相关关系（图4A，斜率=−0.034，P<0.001），Mantel 检验进一步证明了群落结构与地理距离之间的显著关系（r= 0.342， P<0.001）。通过方差分解分析，对各因子（地理距离和土壤理化）的贡献率进行定量，找到造成微生物群落差异的主要因素（图4B）。基于CAP模型的前向选择方法，共找到了四个环境因子包括：pH、TPH、Cd 和 TN，两个PCNM变量和两个线性趋势变量。图中方差分解的所有部分都经过置换方差检验为显著的（P<0.01），所有因子一共解释43.09%的微生物群落方差。土壤环境因子与空间变量（PCNM和线性趋势变量）共同解释了29.04%的微生物群落方差，表明空间变量和环境因子的影响很大程度上相互依赖。土壤环境因子单独解释了1.81%的微生物群落方差。而PCNM和线性趋势变量分别解释了3.74%和8.09%的微生物群落方差，其共同解释的部分为0.41%，因此空间变量单独解释了12.24%的微生物群落方差。综上所述，土壤理化因子和空间距离均能显著影响微生物群落组成。

图4 （A）微生物群落相似性与地理距离之间的相关关系，灰色的直线表示线性拟合。(B) 方差分解分析，Env表示环境因子，Trend表示线性趋势，PCNM表示主轴邻距法选出的变量

3. 共发生网络分析

共发生网络图用来探究微生物之间的相互关系，选取相对丰度大于0.05%的属进行Spearman相关性分析，筛选出相关系数大于0.6且显著性P值小于0.01的相关关系构建相关性网络。网络图共包含95个节点（属）和446条边，每个节点的平均边数是9.389（图5）。一些拓扑特性参数被计算并与同等大小的Erdös−Réyni随机网络图进行了比较。网络拓扑特性参数包括：平均路径长度4.230、聚类系数0.657、模块性指数0.551（大于0.4时说明具有模块结构），这些参数均高于随机网络：平均路径长度2.257、聚类系数0.0995、模块性指数0.241。这表明微生物网络由紧密联系的节点组成，并形成了一种“小世界”的拓扑结构。网络图中的节点主要分属于11个门：Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes和Chloroflexi是主要的五个门，占所有节点的90%。这些节点共形成了4个主要的模块。不同模块中的节点可能发挥不同的功能，且存在强烈的生态联系。在模块I中，许多节点的微生物参与电子转移过程。模块II中大部分类群参与生物地球化学的碳、氮循环过程，模块IV中的大部分微生物参与有机污染物的降解过程。因此，石油污染土壤微生物群落中存在复杂的生物学过程，共发生模式是非随机的且受微生物功能驱动。

图5. 共发生网络分析，节点的大小表示相对丰度，边的厚度表示相关性大小。（A）根据门对节点着色；（B）根据模块对节点着色

小结

本研究分析了五个地区石油污染土壤中环境因子和空间距离对微生物群落构建的影响。pH、总石油烃、总氮、镉含量能显著影响微生物群落构建，微生物α-多样性与pH呈正相关关系而与总石油烃呈负相关关系。在所有样点中，微生物群落的相似度随着地理距离的增加不断减少，且微生物群落构建受空间距离和环境因子的共同驱动，而空间距离单独解释的微生物群落差异比环境变量大。微生物的空间分布表明扩散相关的过程驱动微生生物地理分布。通过网络分析，作者确定了五个关键类群包括Rubrivivax、Nitrospira、Methylotenera、Methyloversatilis和Acidaminobacter，且微生物共发生模式是非随机的，受微生物功能驱动的。结果也表明不同地区的土壤，经过长时间的石油污染，也会形成组成相同且可能功能也相同的微生物类群。

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