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利用群落转录组拼接揭示参与深海碳氮循环的微生物

Community transcriptomic assembly reveals microbes that contribute to deep-sea carbon and nitrogen cycling

作者：Brett J Baker, Cody S Sheik, et al.

期刊：The ISME Journal

时间：2013.5

IF: 9.520

DOI: 10.1038/ismej.2013.85

研究背景

深海是全球生物地球化学循环的重要组成部分，因为它含有地球上最大的活性碳库和氮库。然而，驱动深海地球化学的微生物群落大部分尚未被探索。宏转录组技术为这些未知群落提供了新的研究思路。本研究以宏转录组为工具，研究加利福尼亚湾瓜伊马斯盆地的海底热液中微生物群落的代谢活动。考虑到参考数据集的限制，本研究并没有将宏转录组数据比对到相应宏基因组或者数据库来进行分析，而是采用将宏转录组进行de novo 拼接的方法，重建了海底热液微生物群落转录组，并挖掘出了在宏基因组中被忽略的低丰度的物种，揭示了它们在碳氮代谢中的高转录活性，暗示其在碳氮循环中发挥的重要作用。

样品采集

在采样地加利福尼亚湾瓜伊马斯盆地水下1950 m处收集10 L海底热液（plume），同时收集水下1600 m处的水体作为背景样品（background），用于比较。将收集的水体通过0.2 μm滤膜进行过滤，收集滤膜于液氮中，提取RNA。

主要结果

01. 转录组de novo 拼接

质控后的cDNA序列首先用Velvet进行拼接，随后再用转录组拼接软件Oases进行处理。拼接后得到78250条contigs，预测基因81452个，其中18501（23%）为假定的蛋白编码基因。对于大量的非蛋白编码转录本，可以通过在短片段测序数据中常见的rRNA基因的高水平片段化来解释（由于高度相似序列的精细尺度变异造成）。为了评估RNA数据中微生物多样多样性，将群落cDNA序列比对至16S rRNA 基因数据库（SILVA），发现53%含有16S rRNA的序列属于γ-变形菌（包括甲烷氧化菌和硫氧化菌，SUP05），这与之前的发现是一致的——它们在宏基因组数据中同样占有高覆盖度（图1）。

图1. 基于rRNA转录本的门水平物种丰度

02. 异养微生物

宏转录组拼接揭示了在宏基因组中被忽略的低丰度物种（Altermonoas、Nitrospirae 和MGII）反而有着高丰度的转录本。在Altermonoas中，四类最丰富的转录本分别是TonB、氨基酸转运蛋白、核糖体蛋白S2和一种假定蛋白（图2）。考虑到ATP结合转运蛋白是海洋中异养代谢和摄取溶解有机碳的重要组成部分，作者比较了转录组中ATP结合氨基酸转运蛋白的转录活性。发现转录组中10个最高转录丰度氨基酸转运蛋白中的5个与Marine Group II（MGII）具有高度相似性，表明该组利用外源氨基酸作为碳和/或氮源（图3）。由于Alteromonas菌和MGII群体展现了来自氨基酸转运蛋白的丰富转录本，表明从氨基酸到有机碳和氮的循环利用。

图2. 基因转录本在plume（1950 m）和background（1600 m）样品中的丰度。

将plume和backgound的cDNA reads 映射到plume转录组de novo拼接产物，得到各基因转录本在两个样品中的丰度分布。红色、黄色和绿色圆圈分别代表与Altermonoas、Nitrospirae 和MGII相关的mRNA。灰色圆圈是转录丰度较高的铵转运蛋白，大部分属于氨氧化古菌（AOA）。

图3. 基因转录丰度vs在宏基因组中的覆盖度

03. 宏转录组特异性基因

为了进一步评估仅存在于宏转录组中，而在宏基因组中缺失的序列，将转录本与来自相同地点的宏基因组样品进行比较。共发现8360个宏转录组特异性基因，大小为3.4 Mb。其中3419（41%）个基因无法注释到功能。总体而言，16%（1378个）的宏转录组特异性基因与Altermonoas密切相关，包括丰富的TonB受体和核糖体蛋白（图4）。

图4. 在相应的宏基因组数据中不存在的转录本的cDNA reads映射数以及与NCBI数据库中序列相似度

04. 亚硝酸盐氧化转录本鉴别

在群落中亚硝酸盐氧化及相关能量代谢基因也有着高丰度的转录本（图2），包括亚硝酸盐氧化还原酶（NxrA、NxrB），细胞色素c-type氧化酶和细胞色素bd-type氧化酶。其中除了nrxA，其他基因都与一种属于Nirospirae门的亚硝酸盐氧化菌Candidatus Nitrospira defluvii 最相似。最终得出结论该高丰度转录本编码了一种新型的NXR蛋白来参与有氧硝酸盐氧化过程（图5）。其次，从转录本数据中回收到属于Nitrospirae 的16S rRNA序列，并进行系统发育分析，发现这些序列组成了两个不同的cluster，属于Nitrospirae 门下新成员（图6）。这些结果表明，一种新的细菌群落参与了深海亚硝酸盐氧化。

图5. 亚硝酸盐氧化及相关电子转运蛋白的模型和转录本丰度。

灰色标记的复合体表示在本研究没有找到，但在参考电子传递模型中存在的蛋白。箭头表示电子和质子的传递方向。转录本序列数的标准化是将映射上转录本的cDNA reads数除以基因的长度再乘以1000。

图6. 转录本中与Nitrospira 相似的16S rRNA序列的系统发育树

05. 低丰度高转录活性微生物的丰度和分布

鉴于群落中大部分的转录本来自于群落中非优势物种(MGII, Alteromonas and DONN groups)，为了进一步验证这些物种的丰度和分布，对来自不同水体各个深度的样品进行16S rRNA高通量测序，找到了与这三类微生物对应的OTU，并证实了它们存在于不同地理位置的不同微生物群落中。

小 结

本研究结果表明，对宏转录组数据进行de novo 拼接可以提供在菌株水平评估转录活性群体多样性的能力。更重要的是，它能够重建和功能表征转录本，否则通过映射到参考基因组数据库可能会忽略这些转录本。本文利用这种方法，揭示了低丰度物种Alteromonas、MGII在异养代谢和新型Nitrospirae 在亚硝酸盐氧化中的功能重要性。综上，本文对低丰度高转录活性物种的揭示，引起了人们对生物圈中低丰度物种可以执行重要生态功能这一概念的关注。

文案|谭 莎

编辑|姚晓韵

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