1.1流式细胞术简介

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是利用流式细胞仪检测单个微粒（单细胞悬液、生物颗粒等）的多项特性或对特定群体加以分选的一门技术，具有快速、准确、客观的特点，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。

流式细胞仪（Flow Cytometer）是以流式细胞术为理论基础，集流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机为一体的一种新型高科技仪器，可对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析。

1.2流式细胞术的特点

（1） 速度快：检测速度可达到每秒数千至上万个细胞。

（2） 灵敏度高：每个细胞上只需带有100~300个荧光分子即可被检测出来。

（3） 多参数：多色荧光染色同时分析单个细胞或者生物微粒的多特征。

（4） 纯度高：可以把指定特征的细胞分选出来，目的细胞纯度高达99%以上。

（5） 无毒害：能保持细胞不被破坏，继续进行无毒害定性及定量分析及分选。

1.3流式细胞术在生物学中的应用

细胞凋亡检测与分析、细胞增殖检测与分析、细胞内钙离子浓度的检测与分析、细胞膜电位的检测与分析、细胞表面分子的检测与分析、细胞核酸分析、胞内活性氧水平的检测与分析、细胞内或细胞核内抗原检测与分析。

1.4流式细胞术常用的荧光染料

流式细胞仪常用的荧光染料有很多种，在选择荧光染料的时候首先要考虑它们的分子结构、激发光谱和发射光谱。如氩离子气体激光管，它的发射光波488 nm，常用的荧光染料如下图所示：

1.5流式细胞术常规操作流程

1.5.1样品制备

（1） 培养的贴壁细胞需用0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）消化、PBS洗涤、固定液重悬或者低温保存待用。

（2） 新鲜组织需消化成单细胞悬液（酶处理法、机械法两种方法可选）：消化、生理盐水洗涤、滤网过滤、固定液重悬或者低温保存待用。

（3） 石蜡包埋组织先将蜡块切成10-50 um厚的组织片、研磨、脱蜡、水化，再消化、生理盐水洗涤、滤网过滤、固定液重悬或者低温保存待用。

1.5.2标记荧光抗体

（1） 直接染色：细胞直接结合标记好荧光染料的抗体。它的优点是操作简单，降低二抗的非特性结合背景。

（2） 间接染色：一抗与细胞结合后，再与带荧光标记的二抗结合来检测。

1.5.3流式细胞仪上机检测及数据分析

1.6常见问题回答

如何选择合适的荧光抗体？

流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。间接标记二抗会增加实验步骤、清洗多次造成细胞浪费，会影响实验的准确性，所以在流式实验过程中，尽量选用直接标记的抗体进行实验，尽量减少实验工序和过程，保证实验的真实性和准确性。

实验过程中是否需要设置同型对照？

同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。同型对照是真正意义上的阴性对照，根据同型对照可以判断阳性细胞的位置；一些特异性不高的抗体（如多抗），非特异性结合非常多，使用同型对照可排除假阳性，因此同型对照的设置是需要的。

利用流式软件分析数据时如何设门（gating）？

流式软件数据分析的目的是来确定所分析样本中表达标记物的目的细胞群的阳性率，因此在做流式数据分析时，首先要做的就是要准确地圈出目的细胞群。常见的设门方法有：阈值设门、散射光设门等。

（1）FSC和SSC联合设门

FSC，即前向散射，也称小角散射，值大小与细胞直径成近似直线关系。SSC，即侧向散射，又称90°散射，它对细胞膜、胞质和核膜的折射更为敏感，其散射强度几乎与细胞内颗粒结构的多少近似成正直线关系。由于前向散射光与细胞的大小有关，侧向散射依赖于粒子/细胞的密度（比如胞浆颗粒数量，细胞膜尺寸），根据细胞不同的大小和密度的差异而将细胞群区分开来。FSC和SSC联合设门最大的优点就是可以排除碎片和噪声的干扰。

（2）荧光参数与散射参数（FSC/SSC）组合设门

将细胞的荧光参数与物理性状相结合设门，特别适合检测低表达分子的流式实验。

（3）反向设门

根据被标记细胞的荧光特点，截取某一特定荧光参数的细胞群，在FSC/SSC散点图中找到该群细胞进一步分析。反向设门一般多用于在细胞群中分布相互重叠或者不易确定的细胞群。

温馨提示

*高表达的靶分子用低亮度的荧光染料，低表达的靶分子用高亮度的荧光染料。常用荧光强弱排序为：PE>APC>PE-cy5>Percp-cy5.5>FITC。

*不同公司所生产的抗体因其生产工艺以及抗体对实验过程中的保本处理方式敏感度不同，建议选择与该公司同一流程实验中成套的试剂盒中的抗体。

流式细胞术图片参考：